中国华东地区西瓜甜瓜蔓枯病菌生物学鉴定和特性分析

李苹芳 任润生 姚协丰 徐锦华 羊杏平

目的与意义： 蔓枯病（Didymella bryoniae）是瓜类作物最重要的真菌性病害之一。近年来，随着华东地区西瓜甜瓜种植面积的逐步扩大，种植也大面积重茬，致使各西瓜甜瓜种植区蔓枯病危害也逐年加重，严重制约了西瓜甜瓜产业的发展。本文对来源于华东地区不同种植区的西瓜和甜瓜蔓枯病病株上分离纯化得到的蔓枯病原菌，通过从菌落形态、致病性、菌丝生长速度及产孢能力等生物学特性进行观察和对病原菌的ITS序列进行了分析，进而对蔓枯病菌株进行了遗传多样性分析，并尝试建立蔓枯病菌产孢体系和稳定有效的蔓枯病菌致病鉴定体系。

材料与方法： （1）对不同地区采集的发病组织在其病健交界处剪取4～5 cm长的组织，消毒后将组织块置于PDA平板培养基上，25 ℃恒温培养后挑取边缘菌丝进行纯化。纯化后将分离的菌株接种新鲜黄瓜果皮进行分生孢子的诱导和形态鉴定。（2）病原菌致病力鉴定材料采用‘Sugarlee‘Sugarbaby‘Charleston3个西瓜品种，及‘通甜和‘珍珠2个甜瓜品种。在植株2片真叶时，采用孢子悬浮液（1×106CFU·mL-1）进行喷施接种，接种后覆盖棚膜保湿3 d，温度控制在25 ℃左右。于接种后1周采用九级病级法进行叶片发病情况统计。（3）采用rDNA-ITS扩增引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′）进行病原菌核糖体RNA基因内转录间隔区（rDNA- ITS）序列的扩增和测序。将测得的病菌rDNA-ITS序列在GenBank中进行Blast比对，搜索同源性序列，进而根据本试验菌株与GenBank中已鉴定菌株ITS序列的相似度，初步确定蔓枯病菌种类。此外，采用DNA star对蔓枯病菌的ITS序列进行比较，分析菌株间多态性。

结果与分析： （1）从中国华东地区收集的41个分离菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，所有分离菌株的基板菌丝体初为乳白色，但在4 °C下转移至黑暗时，基板菌絲体变为橄榄绿或黑色同心圆，气生菌丝发达。从菌落、气生菌丝看没有明显的差异;后期基内菌丝形态略有差异。菌丝生长速度显示出差异性，生长最快的JSHM-1达到1.87 cm·d-1，JSDY-1，JSDY-5，JSDY-6生长速度较慢，每天只有1 cm左右。（2）接种黄瓜果实后，大约1周后，在接种块周围可产生大量黑色的分子孢子器，通过显微观察，各菌系产生的孢子大小、形态基本一致为椭球型（花生豆形状），以无色单胞或者双胞为主，双胞的2个细胞大小相等，分子孢子的平均长度和宽度大约为8 μm×3 μm，分子孢子的中间有轻微皱缩。（3）为了比较不同菌株的致病性差异，以西瓜感病材料‘Sugarlee‘Sugarbaby‘Charleston，及甜瓜感病材料‘通甜、中抗蔓枯病材料‘珍珠为试材进行蔓枯病菌致病力测定，每个材料接种10棵，3次重复，1周后统计发病情况，采用10级病情分级统计。综合5个品种发病情况看，JXJJ-2，ZJNB-1，ZJNB-4，ZJNB-9，ZJNB-11，JSJY-2，JSJY-3，JSJY-4，JSJY-7，JSHM-1，JSHM-3，JSLH-1 12个菌株致病力较强，5个品种的病情等级均达到5以上。（4）为了进一步确认这些分离菌株为D. bryonia并揭示这些分离株之间的遗传差异，通过引物对ITS1和ITS4（Genbank注册号分别为KF38671和KF386611）对这些菌株的rDNA-ITS核苷酸序列（长度为545 bp）进行了分析。扩增产物的多重序列比对分析显示，除了从浙江宁波和江苏江阴分离出的13株甜瓜蔓枯菌株，其余菌株与NCBI数据库中的D. bryoniae分离株有99%～100%的一致性。13个菌株与其余菌株的区别为在ITS-1区131位由鸟嘌呤替换为腺嘌呤的单核苷酸替换。通过和前人对蔓枯病原菌株的系统发育树的结果比较，本研究所分离的蔓枯病菌属于D. Bryonia RG I或RG II。通过结合其他Didymella种（包括D. Zeae Maydis、D. Exigua、D. Rabiei、D. Fabae和D. Applanata）的聚类分析，进一步确定本研究分离的蔓枯病菌株为D. bryoniae。

结    论： 本研究对来自中国华东地区不同西瓜甜瓜寄主的GSB病原菌的鉴定和分析结果，将有助于我们在未来可通过选择具有较高致病性的蔓枯病菌株进行西瓜甜瓜品种的抗性评价和抗病育种实践中。