运用18S rDNA克隆文库检测滇池硅藻种群多样性

胡蝶 ，皮之云 ，张志荣 ，陈燕祥 ，邢豫明 ，，程宝文 ，

（1.中国人民解放军陆军军医大学，重庆 400038；2.昆明医科大学，云南 昆明 650500；3.中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650204；4.云南省公安厅，云南 昆明 650228）

硅藻因其细胞壁由不易被破坏的含水硅酸盐构成，在溺水过程中，硅藻可随溺液吸入肺组织并通过血液循环播散至其他组织器官中，因此硅藻检验在法医学溺死诊断中具有重要的意义[1-4]。滇池是云南省最大的淡水湖泊，目前对滇池水域硅藻种群的研究报道较少，主要采用光学显微镜或扫描电镜下形态学特征进行种属鉴定与分类[5-7]。本研究应用分子生物学方法对滇池水域硅藻种群分布进行初步研究，以期为当地溺死的法医学鉴定提供参考以及为滇池水域的生物多样性研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2017年3月22日在滇池6个水样采集点［草海1个（图1A）、外海5个（图1B～F）］水面下0.1～0.5m处采集6份水样，各500mL，静置过夜，弃250mL上层水样，于4℃保存备用。

图1 滇池水样采集点分布

1.2 总DNA制备

各取2 mL水样置于微量离心管中，以离心半径10cm，12000r/min，离心20min，弃上清液，再加入水样离心，弃上清液，反复6次，管底得到沉淀物。沉淀物用PowerSoil® DNA Isolation试剂盒（美国Mobio公司）提取DNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.3 PCR扩增

采用Primer Premier 5.0软件（美国Premier Biosoft公司）设计硅藻18S rDNA特异性引物605F：5′-CTGCGAACGCTCATTAT-3′；605R：5′-AGGCCCGG CATTGTTATT-3′。PCR反应总体积为20μL：去离子水 12.3 μL，10×PCR 缓冲液 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L正反引物各0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA模板1μL。反应条件：95℃ 3min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min。扩增产物用Good ViewTM核酸染料（北京赛百盛基因技术有限公司）染色，通过2%琼脂糖凝胶电泳显带，数据用相机拍照固定。

1.4 克隆文库构建

PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］纯化，纯化产物运用pLB零背景快速连接试剂盒［VT205，天根生化科技（北京）有限公司］克隆。随机挑取阳性菌斑直接进行载体引物PCR扩增检测，阳性扩增产物用Product Pre-Sequencing试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）纯化。纯化体系：虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）1.5μL，Exo-1 0.15μL，去离子水1.35 μL，扩增产物5 μL。反应条件：37℃ 60 min，85℃ 15min。测序反应体系：去离子水4μL，测序缓冲液 1 μL，测序反应试剂 0.3 μL，10 μmol/L 载体正向引物 0.25 μL，DNA 模板 0.5 μL。测序反应条件：95℃ 30 s；96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 3 min；32个循环。测序产物用葡聚糖凝胶G-50（中DNA级，美国GE Healthcare公司）纯化，3500基因分析仪（美国AB公司）测序。

1.5 系统发育树构建

扩增序列通过BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对以确定序列种属，运用MEGA v7.0.14软件（分子进化遗传学研究所，Institute of Molecular Evolutionary Genetics）以距离矩阵邻接法构建滇池水域硅藻18S rDNA系统发育树。

2 结 果

2.1 DNA扩增结果

采用PowerSoil®DNA Isolation试剂盒分别提取6份水样硅藻的DNA，并运用滇池硅藻18S rDNA特异性引物605F和605R进行PCR扩增得到预期目标片段，片段大小约400bp（图2）。

图2 滇池6个水样采集点硅藻18S rDNA扩增结果

2.2 滇池硅藻种群多样性

6个硅藻18S rDNA克隆文库各挑取40个克隆子载体引物扩增测序，共获得196个DNA序列（表1），通过BLAST比对，196个序列中有167个硅藻序列，包括冠盘藻属、等片藻属、直链藻属、菱形藻属、小环藻属、海链藻属、脆杆藻属、舟形藻属、异极藻属、曲壳藻属、楔形藻属11个硅藻种属（表2）。

6个采集点间检出硅藻种群数量不一致，海埂北侧的草海水样检出冠盘藻、小环藻、海链藻、舟形藻、菱形藻、脆杆藻6类硅藻，海埂南侧的外海水样检出冠盘藻、小环藻、菱形藻、等片藻、直链藻5类硅藻，观音山水样检出冠盘藻、菱形藻2类硅藻，东大河湿地公园水样检出冠盘藻、小环藻、海链藻、菱形藻、曲壳藻5类硅藻，捞鱼河湿地公园水样检出冠盘藻、小环藻、海链藻、舟形藻、菱形藻、等片藻、异极藻7类硅藻，海东湿地公园水样检出小环藻、直链藻、楔形藻3类硅藻。

196个序列中有20个为金藻序列（表3），包括囊胞藻属、鱼鳞藻属、棕鞭藻属、黄群藻属，其余9个序列主要包括细菌、真菌等。

表1 各水样的测序情况 （个）

表2 各水样硅藻种属和数量 （个）

表3 各水样金藻种属和数量 （个）

2.3 滇池水域硅藻、金藻18S rDNA系统发育树

本研究所获得的11类硅藻18S rDNA序列和4类金藻18S rDNA序列通过BLAST进行相似性比对，部分序列与硅藻18S rDNA序列具有较高同源性，将相似性较高的序列作为标准序列，利用MEGA v7.0.14软件采用邻接法聚类分析[8]构建系统发育树，结果显示，滇池水域所检出的硅藻与金藻关系较近。

3 讨 论

硅藻广泛分布于海洋、淡水或陆地湿润土壤中，种类繁多，大小不一，从几微米至数毫米，且形态各异[9]。传统的硅藻分类研究是借助显微镜观察硅藻的形态学特征鉴定种属，这就需要研究人员具有非常丰富的分类学经验，且工作量大，耗时长，结果易受人为主观因素干扰，检测标准化难度较大[10]。有文献[6-7]报道用传统方法对滇池浮游生物进行多样性监测，滇池硅藻有小环藻属、冠盘藻属、直链藻属、脆杆藻属、平板藻属、针杆藻属、等片藻属、舟形藻属、羽纹藻属、异极藻属、菱形藻属11个属。本研究运用分子技术从硅藻18S rDNA序列的分析对滇池水域硅藻进行鉴定和分类，检出冠盘藻属、等片藻属、直链藻属、菱形藻属、小环藻属、海链藻属、脆杆藻属、舟形藻属、异极藻属、曲壳藻属、楔形藻属11个属。但未检出传统方法可检出的平板藻、针杆藻、羽纹藻3类硅藻，却检出海链藻、曲壳藻和楔形藻。其原因可能与以下4个方面有关：（1）采样时间不同，滇池水质状况不同，硅藻种群结构会有所差异；（2）与本研究所用引物的敏感性和偏好性有关；（3）本研究所检测的硅藻18S rDNA序列分辨率有限；（4）传统方法具有一定的局限性。因此，本研究结果是对以往研究的验证与补充，使得滇池水域硅藻种群数据更加完善。

滇池6个采集点间硅藻种群结构存在差异，首先，草海检出6类硅藻，外海检出10类硅藻，只有草海检出脆杆藻，外海的5个采集点水样均未检出脆杆藻。海埂两侧水域的硅藻群落有明显差异，草海与外海之间有一航道相通，航道最南端修有人工闸门限制湖水流通是形成海埂两侧水域硅藻群落差异的主要原因，其次是草海底泥清淤相对较为彻底，湖滨湿地修复效果较好，形成了良好的湖滨湿地生态系统，水质较前有所好转[7，11]。滇池外海硅藻种群丰富，包括除脆杆藻之外的10类硅藻。东西两岸采水点水域硅藻种群结构差异明显，西岸观音山水域硅藻种群结构最为单一；东岸的捞鱼河湿地公园水域的硅藻种群结构最为丰富。外海东岸的捞鱼河湿地公园水域与海东湿地公园水域间也有一定的差异，海东湿地公园水域硅藻种群相对单一。外海面积较大，湖流缓慢，湖面常年以西南风为主，外海北岸蓝藻堆积，水质较差[11]，硅藻种群相对单一，东岸沿线湖滨湿地生态系统的建设较完善，光照充足，西南边出水口通畅，硅藻种群相对丰富。不同水域的硅藻种群差异对于法医学溺水地点的推断具有一定的意义。

滇池面积广阔，本研究的水样采集点未能涉及湖泊中央区域以及季节交替所致种群差异，如果建立滇池水域硅藻种群数据库，还需进一步扩大取样范围以及更深入地研究分析积累数据，才能更全面、准确地反映出滇池水域的硅藻分布情况。