甲基硫菌灵及其代谢产物多菌灵在芒果上的残留测定及膳食风险评估

张 月， 张 群， 赵方方， 韩丙军， 黄海珠

(1.中国热带农业科学院 分析测试中心，海南 海口，571101； 2.海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海南 海口，571101； 3.农业农村部热作产品质量安全风险评估实验室，海南 海口 571101)

甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)是日本曹达公司开发的一种广谱内吸苯并咪唑类杀菌剂[1]，该药剂被植物吸收后，通过一系列的生化反应转化为另一种苯并咪唑类杀菌剂多菌灵(Carbendazim)，进而干扰菌类纺锤体的形成，使病菌萌发的芽管异常，从而起到杀菌作用。可用于防治果树和花卉黑星病、炭疽病，对玉米大、小斑病也具有良好的防效[2-6]。甲基硫菌灵降解速度慢，残效期长，随着农药广泛应用到水果、蔬菜和菌类作物后，产生的环境污染、农药残留问题也引起人们越来越多的关注[7-9]。国际食品法典委员会(CAC)规定：甲基硫菌灵的残留定义为甲基硫菌灵和多菌灵残留量之和，我国还没有甲基硫菌灵在芒果上的残留限量值。目前，我国关于各类农药残留的检测方法较多，主要有紫外分光光度法[10]、超高效液相色谱法[11-15]、固相微萃取法、TurboFlow在线净化[16]、液相色谱-串联质谱法[17-18]等。但甲基硫菌灵及其代谢产物在芒果中的残留降解尚未见报道。鉴于此，利用优化后的QuEChERS前处理方法和高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析法，对甲基硫菌灵及代谢物多菌灵在芒果中的残留进行测定，对其消解规律以及最终残留量进行研究，并对甲基硫菌灵行进膳食风险评估，以期为芒果质量安全提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试品种 供试芒果品种为台农与金凤凰。

1.1.2 仪器 液相色谱-串联质谱仪(Waters液相和AB Sciex质谱)，高速冷冻离心机(HITACHI CR22N日本日立)，涡旋振荡器XH-J型(南京东迈科技仪器有限公司)，IKAT25高速分散匀浆机(上海万捷科技有限公司)。

1.1.3 药品与试剂 供试农药为500 g/L甲基硫菌灵悬浮剂。甲基硫菌灵(纯度99.0%，Labor Dr. Ehrenstorfer- Schafers·Bgm)，多菌灵(纯度99.5%，Labor Dr. Ehrenstorfer- Schafers·Bgm)，乙腈(HPLC，Thermofisher)，氯化钠(AR，上海国药)，PSA(美国安捷伦)，甲酸(Thermofisher)，超纯水(实验室自制)。

1.2 试验设计

田间试验于2015和2016年分别在海南和云南进行。其中海南种植芒果品种为台农，云南种植芒果品种为金凤凰，按《农药残留试验准则》[19]和《农药登记残留田间试验标准操作规程》[20]要求设置芒果试验小区，试验小区按施药剂量(低剂量和高剂量)及施药次数(2次，3次)设置，各处理3次重复，共12个小区，每小区种植4棵树，小区间设置隔离区，另设空白对照小区。

1.2.1 消解动态试验 在芒果果实生长至一半大小时，采用喷雾法喷施500 g/L甲基硫菌悬浮剂937.5 mg/kg，施药1次，施药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和28 d采集芒果全果样品，重复3次。以随机方式在小区内用采集样品，在试验小区(树)的不同方向(不同部位)采集2 kg生长正常、无病害的芒果全果，装入样本容器中包扎妥当，待用。

1.2.2 最终残留试验 试验设低剂量和高剂量2个处理，低剂量为625 mg/kg(800倍液)，高剂量为937.5 mg/kg(533.3倍液)，不同剂量处理均分别施药2次和3次，3次重复，小区间设保护隔离区，按照试验设计时间开始第1次施药，施药间隔期为7 d，最后1次施药后5 d、7 d和10 d分别采集不同处理不同小区的芒果全果进行测定。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取 称取5.0 g已打碎的芒果全果样品于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，匀浆2 min，再加入7 g的氯化钠，于涡旋仪上涡旋振荡至完全混匀后，置于离心机上，以4 000 r/min的速度离心3 min，待净化。

1.3.2 净化过程 分别吸取5 mL样品乙腈提取液加入到15 mLPSA管中，再置于10 000 r/min的高速冷冻离心机上离心3 min，过0.22 μm滤膜后用液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 仪器分析条件

1.4.1 液相色谱分析条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温35 ℃，流速为0.3 mL/min，进样体积2.0 μL，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源ESI正离子模式扫描，MRM模式检测，参数设置：碰撞气CAD=6，气帘气(CUR)=20 psi，雾化气(GS1，GS2)=50 psi，喷雾电压(IS)=5 500 V，离子源温度(TEM)=600.0℃。选择性离子监测参数见表2。

1.4.3 方法检出限及定量限 基于最小线性质量浓度的基质标样色谱图，按3倍信噪比计算得出甲的检出限(LOD，S/N=3)，以最小添加水平为定量限(LOQ)。

表2 串联质谱监测模式下待测化合物的检测条件

1.4.4 方法学考察 称取芒果空白样品，每组5个重复，在空白样品中添加甲基硫菌灵和多菌灵的质量分数为0.01 mg/kg、0.10 mg/kg和1.0 mg/kg进行添加回收率试验，按照1.3、1.4.1和1.4.2的方法进行分析。

1.5 风险评估

根据文献[21-22]，甲基硫菌灵的毒理学数据，ADI为0.08 mg/(kg·bw·d)，甲基硫菌灵在芒果中的最大残留限量是1.0 mg/kg。

1.5.1 长期膳食摄入风险评估 长期膳食摄入评估是在毒理学和残留化学评估的基础上，对居民因膳食摄入带来的农药残留对身体健康造成的风险进行定量评价。我国的膳食摄入量主要依据卫生部2002年发布的《中国不同人群消费膳食分组食谱》[23]规定了一般人群某种食品的消费量，包括蔬菜、粮谷类、薯类、千豆及豆制品、水果、畜禽类、奶及奶制品、蛋及蛋制品、鱼奸类、植物油、动物油、糖及淀粉、食盐、酱油等各种食品的每人每日允许摄入量。确定人群的膳食结构和食品消费量，再分别结合残留化学评估推荐的规范STMR或己制定的MRL，计算出国家估算每日摄入量(NEDI)，结合本试验的结果对甲基硫菌灵进行风险评估。

NEDI=∑Fi×CMRL-i

(1)

风险概率=∑NEDI/(ADI×63)×100%

(2)

式中，NEDI为农药的国家估算每日摄入量[m g /(kg·bw·d)]，CMRL-i为第i类农产品的农药残留最大限量值(mg/kg)，Fi为第i类农产品的每人每日平均摄入量[23]。

当风险概率小于100时，提示风险是可接受的，保护水平高。当风险概率大于100时，对消费者健康有不可接受的风险，提示保护水平低。农药的ADI值引用自GB 2763-2016及CAC标准。63为成年人平均体重(kg)[24]。

1.5.2 急性膳食摄入风险评估 用公式(3)计算国家估计短期摄入量，公式(4)和(5)计算农药急性膳食摄入风险(%ARfD)。

(3)

(4)

(5)

根据世界卫生组织数据，芒果单果重Ue 取0.288 8 kg，芒果个体之间变异因子v取值为3[25]。式中NESTI为国家估计短期摄入量[mg/(kg· bw·d)]；LP为芒果消费的大份餐(kg/d),HR为最高残留量(mg/kg),Ue为芒果单果质量(kg),v为芒果个体之间变异因子。ARfD为急性参考剂量[mg/(kg·bw·d)]。当%ARfD≤100%时，表示急性膳食摄入风险可以接受，%ARfD越小，风险越小；反之，当%ARfD>100%时，表示有不可接受的急性风险，%ARfD越大，风险越大。

2 结果与分析

2.1 线性范围、检出限及定量限

从表3可知，甲基硫菌灵和多菌灵的定量离子色谱峰面积(y)均分别与进样质量浓度(x)呈线性相关。甲基硫菌灵和多菌灵在芒果中的定量限(LOQ)和检出限(LOD)均分别为0.01 mg/kg和4.0 pg。

表3 甲基硫菌灵和多菌灵的线性方程、定量限和检出限

2.2 方法学考察

从表4可知，甲基硫菌灵和多菌灵平均回收率分别为84.7%～112.0%和79.2%～103.0%，RSD分别为2.7%～5.8%和3.0%～4.4%。根据《农药残留试验准则》[19]，0.01<农药残留量≤0.1，回收率在70%～120%，RSD≤20%，0.1<农药残留量≤1，回收率在70%～110%，RSD≤15%，测定方法的回收率和RSD均在标准范围内，说明该检测方法可靠，适用于芒果中的甲基硫菌灵和多菌灵的检测。

表4甲基硫菌灵和多菌灵在芒果样品中的回收率和相对标准偏差(n=5)

Table 4 Recovery and relative standard deviation of thiophanate-methyl and carbendazim in mango samples (n=5)

化合物Compounds添加水平/(mg/kg)Adding level平均回收率/%Averagerecovery rateRSD/%甲基硫菌灵 Thiophanate methyl0.0184.74.20.10112.002.71.00104.005.8多菌灵 Carbendazim0.01103.004.40.1079.203.01.0087.103.8

2.3 甲基硫菌灵在芒果中的消解动态

种植于海南的芒果甲基硫菌灵(以多菌灵计)的消解半衰期在2015和2016年分别为9.5 d和9.9 d，消解动态方程分别为y=1.254 5e-0.073x和y=0.609 8e-0.07x，相关系数分别为0.930 7和0.856 1；种植于云南的芒果甲基硫菌灵(以多菌灵计)的消解半衰期在2015和2016年分别为12.6 d和9.8 d，消解动态方程分别为y=3.013 4e-0.055x和y=1.679 5e-0.071x，相关系数分别为0.969 4和0.859 1，甲基硫菌灵(以多菌灵计)在芒果中的消解动态符合一级动力学方程。

2.4 最终残留

由表5可知，在海南、云南试验点，芒果中的甲基硫菌灵残留量均表现为高剂量残留量高于低剂量残留量，3次施药高于2次施药，施药后7 d，采收时，甲基硫菌灵在芒果中的残留中值为 0.410 mg/kg，残留最大值为0.993 mg/kg，低于欧盟中甲基硫菌灵在芒果上的MRL值1.0 mg/kg。

表5施药后7d甲基硫菌灵在芒果中的残留量

Table 5 Residues of thiophanate-methyl in mango after seven days of application

年份Year地点 Location施药剂量/(mg/kg) Dosage施药次数/次Application frequency残留量/(mg/kg)Residue2015年海南62520.15330.239937.520.58730.5472016年海南62520.39430.290937.520.48030.8062015年云南62520.57630.789937.520.83130.9932016年云南62520.12030.200937.520.19130.206

2.5 风险评估

2.5.1 长期膳食摄入风险评估 在对甲基硫菌灵(以多菌灵计)现有MRL标准对消费者的保护水平进行评估时，其MRL值优先取值我国标准，根据GB 2763—2016食品中农药最大残留限量[22]及《食品中农药最大残留限量》的统计，制定的甲基硫菌灵(以多菌灵计)残留限量的食物种类、相应MRL和限量来源(表6)，结合中国农药登记情况和中国居民人均膳食结构，得到普通人群甲基硫菌灵的每日理论最大摄入量为2.020 970 9 mg，占日允许摄入量的5.04%，风险概率为40.10%，表明现行甲基硫菌灵MRL标准对消费者在长期摄入风险方面的保护程度高，通常不会对一般人群健康产生不可接受的风险。

2.5.2 农药残留急性风险评估 试验最高残留量采用所有处理中残留量的最大值 0.993 mg/kg，芒果单个食品质量取 WHO (世界卫生组织)提供的各国的平均值 0.288 8 kg[23]，甲基硫菌灵的ARfD值采用 2017年JMPR报告确定的1 mg/(kg ·bw·d)[25]进行计算。结果 (表7)表明,芒果中甲基硫菌灵残留对中国各类人群的短期膳食摄入暴露量为 0.002 5～0.013 0 mg/(kg ·bw·d)，虽然不同人群的评估结果有差异，儿童 (≤ 6岁)的暴露量高于其他人群，但总体均较低，仅占急性参考剂量ARfD的 0.25%～1.30%，远低于 100%，说明急性风险很低，而且基于残留试验获得的甲基硫菌灵残留水平均远低于芒果中甲基硫菌灵残留在一般人群和儿童中的安全界限。

表7 甲基硫菌灵的急性风险评估

3 结论

试验采用高效液相色谱-质谱串联法对芒果中甲基硫菌灵及代谢产物多菌灵额残留进行测定，该方法重现性良好，灵敏度高，准确度与精确度均符合农药残留检测分析的要求。甲基硫菌灵在芒果中的消解动态符合一级动力学方程，海南芒果甲基硫菌灵半衰期2015年和2016年分别为 9.5 d和9.9 d，云南芒果甲基硫菌灵半衰期分别为12.6 d和9.8 d；最终残留试验结果表明，2015年和2016年施药后间隔期7 d，采收时，甲基硫菌灵在芒果中的残留中值为 0.410 mg/kg，低于欧盟中甲基硫菌灵在芒果上的MRL值(1.0 mg/kg)。芒果中甲基硫菌灵残留带来的膳食摄入风险和急性膳食摄入风险均很低，在可接受范围内。以上结果可为制定甲基硫菌灵在芒果中的使用规程、规范甲基硫菌灵在芒果中的使用、制定其MRL值及其加强对甲基硫菌灵残留的监管提供理论基础和依据。