外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟光合特性及碳氮代谢关键酶活性的影响

张艾改，刘国顺，云 菲，张 林

河南农业大学烟草学院烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州市金水区文化路95 号 450002

烟草是喜光作物，对光、温环境变化十分敏感。旺长期是烟草叶片分化、生长的关键时期，对烟株叶片的数量、大小、干物质积累及烟叶产量和品质的形成起着重要作用[1]。烟草旺长期间若遇到高温、强光、干旱等不利环境因子，会严重影响烟株生长[2]。高温伴随强光会导致植株体内物质代谢紊乱、光合作用受到严重影响[3-5]。而葡萄糖作为一种保守的信号分子[6]，能够调控植物体一系列基因的表达，如信号转导、碳水化合物代谢以及与代谢转运、胁迫响应等相关的基因[6]。碳氮代谢的协调程度会受到一系列信号因子的调控，其中糖类物质通过调节碳氮代谢过程中相关基因的表达以及酶活性进行调控[7]。此外，糖类物质具有类似植物激素的初始信使作用，参与植物体的渗透调节[8-9]。皇甫晓琼[10]通过高温强光胁迫处理，发现胁迫处理下烤烟K326 苗期叶片的光合能力增强，光系统Ⅱ反应中心的开放程度降低，吸收的光能多用于热耗散和非光化学反应耗散；谷氨酰胺合成酶（GS）活性升高，烤烟叶片氨同化能力增强，但硝酸还原酶活性降低，烤烟对硝态氮的利用率下降。张金飞等[11]研究提出，喷施外源葡萄糖可增加水稻光合作用底物，维持光合性能稳定，减缓干旱胁迫，进而维持产量稳定。于翠等[8]认为外源葡萄糖可以减轻盐胁迫对植株光合机构的伤害，增强植株的光化学反应能力，提高PSⅡ光化学效率。王雅楠等[12]试验发现外源葡萄糖可提高胁迫下小麦碳、氮养分的积累量，提高碳氮代谢水平。目前，外源葡萄糖在逆境胁迫条件下增强植物耐受性、减轻伤害方面的研究主要集中在小麦、水稻、山楂等作物和果树上，在烟草上则未见报道。同时，旺长期高温强光胁迫对烤烟光合生理特性、碳氮代谢影响方面的研究也鲜见报道。因此，进行了外源葡萄糖喷施对旺长期高温强光下烤烟光合特性及碳氮代谢的影响试验，旨在为外源葡萄糖在烟叶生产上的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2018 年进行，地点设置在河南省许昌县苏桥镇河南农业大学许昌校区（北纬34°01′，东经113°49′）。供试烤烟品种为K326，土壤为砂壤土，有机质19.8 g/kg，碱解氮81.6 mg/kg，速效磷10.1 mg/kg，速效钾126.6 mg/kg，全碳16.4 mg/g，全氮1.5 mg/g，pH 7.66。按120 cm×50 cm 行株距进行盆栽，盆高40 cm，盆口直径37 cm，盆底直径27 cm，每盆装土25 kg。采用漂浮育苗[13]，将烟草包衣种子播种于盛有基质的育苗盘中，基质成分为草炭∶蛭石∶膨化珍珠岩=3∶1∶1，待烟苗长至8 片真叶时，选取生长一致的烟苗于5 月7 日移栽，每盆1 株，每处理20 株，按照当地优质烟叶生产技术规范进行管理。

选取移栽后35 d 生长一致的烟株，设置两个试验处理。处理1（C0.5）：喷施0.5 mmol/L 的葡萄糖溶液（预备实验中已对烤烟品种K326分别设置了0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L 的葡萄糖溶液进行喷施处理，确定葡萄糖溶液的最适浓度为0.5 mmol/L）；处理2（对照CK）：以等量等浓度蒸馏水喷施烟株。选择晴朗无风的天气，于每天8：00 和18：00 分2 次均匀喷施叶片正反面，喷至叶片有明显水珠滴落为止，连续喷施3 d；第4 天转至人工气候室进行高温强光处理。高光照强度由1 000 w 的钨灯控制，通过照度计（美国Kestrel 公司，Model MQ-100）测定其有效辐射强度。每天10：30～15：30 进行5 h 的强光处理（实际光照强度为1 500～1 800 μmol·m-2·s-1），其余时间各处理均恢复为正常的光照条件（800～1 000 μmol·m-2·s-1）。各处理温度保持一致，分4 个时段：5：00～8：00，32 ℃；8：00～18：00，36 ℃；18：00～23：00，34 ℃；23：00～5：00，30 ℃。烟株每两天浇水1 次，每次3 L，保证试验期间各处理盆栽土壤的水分和养分条件均维持在适宜且等量的水平，处理10 d 后选择晴朗的天气取样并进行相关指标的测定。

1.2 测定方法

1.2.1 光合色素含量的测定

选取经高温强光处理10 d 后生长一致受光方向相同的第5 片展开叶（自上而下）进行测定，称取0.2 g 剪碎的新鲜烟叶放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2～3 mL95%乙醇，研磨成匀浆，研磨至组织变白，过滤到25 mL 棕色容量瓶中，用95%的乙醇定容，采用紫外分光光度计在665、649和470 nm 处比色，计算叶绿素和类胡萝卜素含量（质量分数），每处理3 次重复。

1.2.2 光合指标的测定

采用CIRAS-2 便携式光合作用测定仪（美国PP Systems 公司），于上午8：30～11：30 测定净光合速率（Pn）、蒸腾速率（E）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）等参数，测定光强为1 000 μmol·m-2·s-1。选取生长一致受光方向相同的第5 片展开叶，每处理测定6 株，每株测定3 次，取平均值。

1.2.3 叶绿素荧光参数的测定

叶绿素荧光参数的测定与光合指标同时进行，选择与测定光合指标相同部位的叶片，采用FMS-2 脉冲调制式荧光仪（英国Hansatech 公司）测定叶绿素荧光参数。包括叶片光适应下的稳态荧光（Fs）、最大荧光（Fm'）及最小荧光（Fo'），以及叶片暗适应20 min 后的初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）等。并参照Genty 等[14]的方法计算PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm、实际光化学效率ΦPSⅡ=（Fm'-Fs）/Fm'、电 子 传 递 效 率ETR=0.5×ΦPS Ⅱ×PAR×0.84、光化学猝灭系数qp=（Fm'-Fs）/（Fm'-Fo'）、非光化学猝灭系数NPQ=（Fm-Fm'）/Fm'。每处理测定6株，每株测定3 次，取平均值。

1.2.4 碳氮代谢关键酶活性的测定

取中部叶片，避开主脉剪下，立即置于液氮中保存。称取0.1 g 鲜烟样，用试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定谷氨酰胺合成酶（GS）和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）活性，测定方法按照两种酶试剂盒的说明书进行。每处理6 次重复。

1.2.5 数据处理

采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，Microsoft Excel 2013 作图。用Duncan 新复极差法进行数据间差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟光合色素含量的影响

从图1可知，高温强光条件下，葡萄糖处理（C0.5）旺长期烤烟叶片叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、类胡萝卜素（Car）含量、总叶绿素[Chl（a+b）]含量均显著增加，分别比对照增加了17.56%、30.43%、18.52% 、20.90% ；Chla/Chlb 比 值 比 对 照 增 加11.67%，与对照间差异达到极显著水平。说明在高温强光下，旺长期烤烟喷施葡萄糖可显著增加光合色素含量，促使烟株吸收更多的光能，以适应高温强光胁迫环境[15]。此外，烤烟叶片Chlb、Chl（a+b）含量与净光合速率（Pn）间均存在显著正相关关系（r=0.880*、r=0.838*）；Chla、Car 与气孔导度（Gs）均呈显著正相关（r=0.915*、r=0.885*），Chlb、Chl（a+b）与气孔导度（Gs）均呈极显著正相关（r=0.938**、r=0.974**）；Chla、Car 与蒸腾速率（E）的相关性达到极显著水平（r=0.958**、r=0.924**）。

2.2 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟叶片气体交换参数的影响

图1 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟光合色素含量及叶绿素a/b 比值的影响Fig.1 Effects of exogenous glucose on photosynthetic pigment contents and Chla/Chlb ratio of flue-cured tobacco at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

从表1 可以看出，旺长期喷施葡萄糖后烟株的净光合速率（Pn）较对照增加10.60%，气孔导度（Gs）和蒸腾速率（E）分别较对照增加47.98%、36.11%，胞间CO2浓度（Ci）则较对照降低25.17%。这说明在高温强光条件下，葡萄糖处理后能够提高叶片的光合速率和蒸腾速率、维持正常的气孔开度。气孔的开闭与光合作用关系密切，烟株通过调节气孔的开闭维持较高的气体交换能力，从而提高净光合速率[16]。

2.3 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟叶片叶绿素荧光参数的影响

由表2 可知，旺长期经葡萄糖处理后的烤烟叶片，除NPQ、Fo外各指标均显著高于对照。初始荧光Fo较对照降低13.58%，说明外源葡萄糖可以减轻胁迫环境对旺长期烟株光合机构的伤害，保持光合机构的完整性；与对照相比，Fv/Fm升高6.76%，表明喷施外源葡萄糖可保护PSⅡ潜在活性中心免受损伤，提高光能利用率，有利于暗反应阶段CO2的固定与同化；qp、ETR 较对照分别升高19.05%、25.07%，NPQ 较对照降低67.74%，说明喷施葡萄糖可使PSⅡ天线色素捕获光能用于光化学电子传递的份额增多，以热能形式耗散掉的份额减少，光合电子传递活性升高；ΦPSⅡ的升高，说明外源葡萄糖可降低高温强光胁迫下烟株的非光化学耗散，增强光化学反应能力，进而提高烟株的光化学效率[17]。喷施葡萄糖后的烟株在高温强光胁迫下各参数与对照间差异均达到显著水平。外源葡萄糖对高温强光胁迫下烟株叶绿素荧光参数的影响与其光合参数的影响规律相吻合。

此外，净光合速率（Pn）与Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR均存在显著正相关关系（r=0.856*、r=0.922*、r=0.848*），与qp存在极显著正相关关系（r=0.899**）；气孔导度（Gs）与Fv/Fm、ΦPSⅡ均呈显著正相关（r=0.910*、r=0.890*），与qp和ETR呈极显著正相关（r=0.932**、r=0.994**）；蒸腾速率（E）与Fv/Fm的相关性达到极显著水平（r=0.919**），与qp 和ETR 的相关性达到显著水平（r=0.829*、r=0.897*）；胞间CO2浓度（Ci）与NPQ 呈极显著正相关（r=0.924**）。

2.4 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟叶片碳氮代谢关键酶活性的影响

2.4.1 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟叶片谷氨酰胺合成酶活性的影响

谷氨酰胺合成酶（GS）是处于氮代谢中心的多功能酶，参与氨同化和谷氨酰胺形成等多种氮代谢的调节[18]。由图2 可知，高温强光下，旺长期喷施葡萄糖后烟株的GS 酶活性较对照增加18.90%，这说明外源葡萄糖施用可增加高温强光胁迫下烟株对铵态氮的利用率，增强烤烟叶片氨同化的能力，增加谷氨酰胺的生成量，进而加速含氮化合物的合成与转化，促进烟株的生长发育。由表3 可知，GS 与Gs、Fv/Fm、qp、ETR 呈极显著正相关，与Pn、E、ΦPSⅡ存在显著正相关关系（P＜0.05）。

表1 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟光合性能指标的影响①Tab.1 Effects of exogenous glucose on photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

表2 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烟叶叶绿素荧光参数的影响Tab.2 Effects of exogenous glucose on chlorophyll fluorescence parameters of tobacco leaves at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

图2 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟叶片谷氨酰胺合成酶活性的影响Fig.2 Effects of exogenous glucose on glutamine synthase activity at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

表3 碳氮代谢关键酶活性与光合、荧光参数指标间的相关性分析Tab.3 Correlation analysis between key enzymes activities in carbon and nitrogen metabolism and photosynthetic and fluorescence parameter indexes

2.4.2 外源葡萄糖对高温强光下旺长期烤烟叶片1，5-二磷酸核酮糖羧化酶活性的影响

1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）是光合碳循环过程中的关键限速酶，也是作物产量的限速酶，其活性的高低与PSⅡ反应中心的光化学效率关系密切[19]。由图3 可知，高温强光下，葡萄糖处理烟株的Rubisco 活性较对照显著增加67.08%，致使叶肉细胞光化学活性升高，同化CO2的能力增强，最终光合能力增强，与Pn的变化规律相似。Rubisco 与Pn、E、ΦPSⅡ呈显著正相关，与Gs、ETR呈极显著正相关（表3）。

图3 外源葡萄糖对旺长期高温强光下1，5-二磷酸核酮糖羧化酶活性的影响Fig.3 Effects of exogenous glucose on 1，5-diphosphate ribulose carboxylase activity at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

3 讨论

葡萄糖在响应非生物逆境胁迫中发挥着重要的调控作用[20]。本试验结果表明，高温强光下喷施外源葡萄糖能显著提高烤烟叶片叶绿素和类胡萝卜素含量，提高Chla/Chlb 比值。这可能是因为外源葡萄糖能保护烟株叶片的叶绿体膜，保持其结构的稳定性，缓解高温强光胁迫对叶绿体结构的影响所致，与胡梦芸等[15]、曹光峰等[21]的试验结果基本一致。而叶绿体结构的稳定性对植物进行光合作用至关重要，高温强光条件下喷施外源葡萄糖可以显著增加烤烟的Pn、Gs、E，表明烤烟的光合同化能力提高，一方面由于外施葡萄糖可以改变烟株体内内源糖含量，并通过调控糖感受器HXK 及与钙离子相关的CBL-SnRK31/SnPK34 基因的表达来调控保卫细胞的运动，进而控制气孔的开闭[11]；另一方面较高的蒸腾速率可降低烟株叶片的表面温度，进一步降低热耗散，从而对光合机构起到保护作用[22]；此外，烟株Ci与Gs的变化方向相反，说明Ci的降低不是由于气孔限制而引起CO2向叶绿体的输送减少所致，而是由于葡萄糖促使叶肉细胞光合活性升高，叶片同化CO2的能力增强，叶肉细胞间隙CO2的消耗速率增加引起的[17]。

在非生物胁迫下，植物体内可溶性糖含量升高，可溶性糖的积累有利于植株的胁迫保护[23-24]。分析叶绿素荧光参数的变化有助于了解逆境胁迫下光合系统受伤害的程度[25]。本试验条件下，外源葡萄糖可以显著提高烤烟的qp、ΦPSⅡ、ETR，其中Fv/Fm虽有升高的趋势，但变化幅度较小，显著降低了烤烟的Fo、NPQ。这进一步说明外源葡萄糖一方面可以减轻光抑制，避免PSII 放氧复合体脱离反应中心失活，另一方面维持较高的能量转换效率与类囊体膜上的电子传递活性及速率，减少光能耗散的比例，提高烟株的光合效率，与李改玲等[26]、于翠等[8]的研究结果一致。

1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）是光合碳循环过程中的关键限速酶，其活性高低决定着叶肉细胞光合活性及光合暗反应能力的大小[27]。本试验结果表明，高温强光下喷施外源葡萄糖能显著提高烤烟Rubisco 酶活性，且Rubisco 酶活性与Pn、E 呈显著相关关系。这可能与外源葡萄糖通过维持较高的Rubisco 羧化效率促进了烟叶光合速率的提高有关。有研究指出，糖对涉及与氮代谢有关的酶有调节作用[28]。高温强光下喷施外源葡萄糖可显著提高GS 酶活性，有效地增加了氨的同化量。GS 酶活性的增加有可能是由于葡萄糖充当了与一氧化氮在氮代谢中的相同作用[29-30]。但有关外源葡萄糖对高温强光下烤烟光合作用的促进机制、光保护作用机理以及碳氮代谢机制方面还有待进一步深入研究。

4 结论

在人工气候室模拟豫中烟区烤烟旺长期高温强光环境条件下，烟株喷施外源葡萄糖（0.5 mmol/L）的盆栽试验结果表明：外源葡萄糖对旺长期高温强光下烤烟叶片光合作用、荧光效率、碳氮代谢关键酶活性具有积极作用。喷施外源葡萄糖提高了烟草叶片叶绿素含量、净光合速率及碳同化速率；同时外源葡萄糖可保护PSⅡ潜在活性中心免受损伤，降低高温强光胁迫下烟草的非光化学耗散，提高烟草的光化学效率；施用外源葡萄糖还提高了烟草谷氨酰胺合成酶和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶活性，同时提高烟株协调体内物质代谢的能力。因此，施用外源葡萄糖可在一定程度上保护烟草叶片光合机构免于高温强光的伤害，显著提高PSII 活性，并通过提高碳同化能力以利用过剩的光能，进而提高高温强光胁迫下烟草的光合能力。