GC-MS/MS 法结合多元统计过程控制应用于烟用香精的质量监控

蒋成勇，杜国荣，王丽达，张 杰，严莉红，白若石，郑晓曼，芦 楠，周 骏

上海烟草集团有限责任公司技术中心北京工作站，北京市通州区万盛南街99 号101121

烟用香精的质量监控一直是香精企业和卷烟生产企业高度关注的问题，目前，主要依照系列行业标准测定烟用香精折光指数、相对密度和酸值等指标来监控香精质量[1]。然而，烟用香精是一个复杂的多组分体系，各组分对香味的贡献存在协同效应，即使含量极少的香气组分也可能对卷烟的感官品质产生较大影响[2]。因此，对烟用香精中全组分香气成分进行监控，不仅可以清楚地了解香精的内在品质，还可以掌握各批次香精的质量波动情况，有助于稳定卷烟产品质量。

通过化学组分监控烟用香精质量，主要采用气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用法（GCMS）、全二维气相色谱-飞行时间质谱法（GC×GC-TOFMS）和液相色谱法（HPLC）等分析手段结合化学计量学方法[3-12]。GC-MS/MS 近年来发展迅速，已在农药残留、环境污染物、烟草化学等研究领域得到了广泛应用[13-16]，由于该方法选择性好且具有高通量和高灵敏度的优点，因此在烟用香精复杂体系的分析方面具有较大的应用空间。

采用多元统计过程控制（Multivariate Statistical Process Control，MSPC）方法进行质量监控，主要是利用正常状态下的样品测量信息建立多元统计模型，将大量的过程变量通过多元统计的方法投影到由少量隐变量定义的低维空间中，并通过计算各样品的统计量（如Hotelling T2、平方预测误差Q等）和以统计量建立控制图，使过程监控、质量检测及相应研究得到简化[17]。近年来，MSPC 技术在药物制造、食品与饲料生产、卷烟制丝过程等领域得到了广泛的应用[18]。

本研究中采用GC-MS/MS 分析方法结合基于主成分分析的MSPC 技术，建立烟用香精质量监控评价方法，通过监测香气成分变化实现烟用香精的质量监控，旨在为进一步研究卷烟产品加香工艺、产品质量监控及卷烟调香提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

配方香精A（溶剂为乙醇和丙二醇）为卷烟表香香精产品，由北京卷烟厂提供。

无水乙醇、丙酮、环己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯（色谱纯，美国Fisher 公司）；丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸异戊酯、（+）-柠檬烯、异丁酸异戊酯、异戊醇、正己酸乙酯、异戊酸丁酯、丁酸异戊酯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、异戊酸异戊酯、丁酸戊酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸异戊酯、对甲苯甲醚、辛酸乙酯、乙酸、己酸异戊酯、过氧化乙酰丙酮、苯甲醛、丙酸、芳樟醇、乙酸芳樟酯、5-甲基糠醛、β-石竹烯、γ-戊内酯、乙酰丙酸乙酯、γ-丁内酯、薄荷醇、苯乙酮、苯甲酸乙酯、糠醇、丁二酸二乙酯、异戊酸、乙酸松油酯、α-松油醇、十二醛、乙酸橙花酯、乙酸苄酯、2-甲基戊酸、苯乙酸乙酯、甲基环戊烯醇酮、α-紫罗兰酮、苯甲醇、乙基环戊烯醇酮、苯乙醇、β-紫罗兰酮、麦芽酚、β-氧化石竹烯、乙基麦芽酚、对茴香醛、4-羟基-2,5-二甲基-3（2H）呋喃酮、反式-橙花叔醇、DL-苹果酸二乙酯、十四酸乙酯、肉桂酸甲酯、肉桂酸乙酯、对甲氧基苯乙酮、对甲氧基苯基丙酮、丁香酚、棕榈酸乙酯、茴香醇、异丁香酚、苄醚、十八酸乙酯、5-羟甲基糠醛、乙基香兰素、香兰素、苯甲酸苄酯、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛等72 种香气物质标准品（95%～99%，北京百灵威科技有限公司）；苯甲酸正丙酯（99%，日本TCI 公司）。

7890B-7000D 型GC-MS/MS、MassHunter QQQ定量分析软件（Version B.07.01 SP1）（美国Agilent公司）；D-78224 型超声波清洗仪（德国Elma 公司）；PI-214 型电子天平（感量0.000 1 g，美国Denver Instrument 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取5 g 苯甲酸正丙酯标准品，用无水乙醇定容于100 mL 容量瓶中，得质量浓度为50 mg/mL 的内标储备液。移取0.1 mL 内标储备液于100 mL 容量瓶中，用无水乙醇稀释并定容，得质量浓度为50的内标标准工作液。分别称取香气标准物质各0.1 g（精确至0.1 mg），用丙酮溶解后定容于100 mL 容量瓶中，配制成质量浓度为1 mg/mL 的标准样品混合液，并置于4 ℃冰箱中保存备用，使用前将其恢复至室温。

1.2.2 样品前处理

准确称取0.5 g（精确至0.1 mg）试样于25 mL具塞三角瓶中，加入10 mL 丙酮和内标溶液，再加入5 g 无水硫酸钠，轻摇至无水硫酸钠不变化；超声提取5 min，静置5 min；将提取液用微孔滤膜过滤，进行GC-MS/MS 分析。分析条件为：

色谱柱：DB-WAX 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL，不分流进样；恒流模式，柱流量1 mL/min；升温程序：初始温度45 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 的速率升温至200 ℃，再以10 ℃/min 的速率升温至240 ℃，保持5 min。电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度：250 ℃；Q1 和Q3 温度：150 ℃；碰撞气：N2（99.999%），流速1.5 mL/min；淬灭气：He，流速2.25 mL/min；扫描方式：Scan、SIM、多反应监测（MRM）模式。

1.2.3 感官评价

以配方香精A 为表香的“中南海”卷烟产品作为对照样，采用调整不同添加比例（±20%、±10%、±5%）的配方香精A 制作待测样品卷烟；按照行业标准YC/T 138—1998《烟草及烟草制品 感官评价方法》，组织7 名具有资质的评吸人员组成评吸小组对样品进行感官评价；采用三点检验法评估待测样品与对照样之间差异显著性。

1.2.4 数据分析

在MassHunter QQQ 定量分析工作站打开采集的MRM 数据，利用编辑好的分析方法对目标物峰进行自动积分，得到各目标物的峰面积。用相对峰面积（各目标物的峰面积与内标峰面积的比值）对样品进行半定量分析。采用基于PCA 的MSPC 方法对正常状态下采集的烟用香精成分半定量结果进行分析并建立模型，计算统计 量Hotelling T2，以3σ 为 控 制 上 限，绘 制 控制图。

2 结果与讨论

2.1 全组分香气成分定性分析

选择不同极性溶剂（乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和环己烷）和不同色谱柱（DB-5MS 和DBWAX）对香精样品进行提取和分离，采用3 种方式进行全组分香气成分定性分析。①保留时间确认：以GC-MS 全扫描方式分析待测样品，首先通过NIST 谱库匹配确定目标香气成分，然后比较标准样品与待测样品中目标香气成分保留时间的一致性。②标准加入法：将配制的标准样品溶液加入到香精样品中进行提取和分析，并与未加入标准样品溶液的样品进行对比分析，目标香气成分的色谱峰显著增高。③MRM 监测：针对每种目标香气成分，通过优化碰撞电压，挑选出两对离子对分别用于定量和定性分析。从配方香精A 中共鉴定出72 种全组分香气成分，其MRM 参数见表1。由于三重四级杆串联质谱具有高通量离子传输性能和碰撞室零串扰技术特点，因此可有效解决重叠组分和基质干扰问题，进而提高定性和定量的准确性。

2.2 提取分析方法优化

表1 72 种香气成分定性分析参数及方法学评价Tab.1 Qualitative parameters of 72 aroma components and methodology evaluation

表1（续）

表1（续）

2.2.1 分离色谱柱的选择

由于配方香精A 中香气成分种类较多，结构复杂，且极性差异较大，部分化合物如乙酸、丙酸、异戊酸等极性香气成分相对含量较高，但其在非极性色谱柱（DB-5MS）上的保留能力较小且易造成较高的柱流失。因此，为了最大限度获取全组分香气成分，选择DB-WAX 柱进行香气成分分离。

2.2.2 提取溶剂的选择

分别称取5 份同一批次香精样品各0.5 g 于5个25 mL 具塞三角瓶中，分别以乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和环己烷为溶剂，考察提取溶剂对香气成分提取效率的影响，结果如图1 所示。结果表明，以丙酮为溶剂提取出的香气成分数量最多且总量最高。香精中香气成分种类多、性质差异大，而丙酮是偏极性溶剂，可以更好地提取多种成分，因此选择丙酮作为提取溶剂。

图1 溶剂对提取效率的影响Fig.1 Influence of solvent on extraction efficiency

2.2.3 提取时间的优化

分别称取6 份同一批次香精样品各0.5 g 于25 mL具塞三角瓶中，加入5 g无水硫酸钠、10 mL 丙酮和20内标溶液，考察超声提取时间（5、10、15、20、30 和40 min）对香气成分提取效率的影响。结果（图2）表明，超声时间对香气成分的提取结果影响较小，相对标准偏差（RSD）为0.52%。综合考虑，选取超声提取时间为5 min。

图2 时间对提取效率的影响Fig.2 Influence of time on extraction efficiency

2.2.4 料液比的选择

分别称取5 份同一批次香精样品各1.0 g 于50 mL 具塞三角瓶中，分别加入5 g 无水硫酸钠、不同体积（5、10、15、20 和30 mL）丙酮和相应量的内标溶液，超声提取5 min 后进样分析，考察料液比（g∶mL）对香气成分提取效率的影响，结果如图3所示。结果表明，香气成分的提取量随料液比的减小而增大，当料液比＜1∶20 时，香气成分的提取量趋于稳定。因此确定料液比为1∶20。

图3 溶剂体积对提取效率的影响Fig.3 Influence of solvent volume on extraction efficiency

2.3 方法的检出限、回收率和重复性

取1.2.1 中配制的香气成分标准溶液1 mL，用丙酮定容于100 mL容量瓶，配制成浓度为10的标准溶液进行GC-MS/MS 分析，以3 倍信噪比为检出限。结果（表1）表明，大多数香气成分的检出限均小于1.0 ng/mL。

采用标准加入法在高、中、低3 个浓度下考察香气成分的回收率。结果（表1）表明，香气成分的加标回收率为80%～120%。

以日内测定结果的重复性和日间测定结果的重复性来评价方法的重复性。对同一批次样品在1 d内进行15 次平行处理和检测，计算RSD；对同一批次样品每天平行测定5 次，连续测定3 d，计算RSD。结果（表1）表明，大多数香气成分的日内重复性（RSD）＜3%，日间重复性＜5%，说明本方法重复性较好。

2.4 香精质量监控模型的建立及应用

2.4.1 模型的建立

选择12 个批次配方香精A进行GC-MS/MS 分析，每个批次样品抽样测定5 次，获取60 个样品的72 种香气成分的半定量分析结果。由于香气成分含量差别较大，而其对感官质量的贡献也有差异。为了将香气成分波动对感官质量的影响引入到质量监控模型，采用调整加香比例（±20%、±10%、±5%）的方式制作样品卷烟进行感官评吸。结果表明，增加5%的香精用量，感官质量无明显差异，其余加香比例则出现不同程度的感官质量差异。因此，将增加5%加香比例的配方香精香气成分分析结果作为建模样本数据，并建立烟用香精质控模型。

基于PCA 方法建立MSPC 模型时，一般要求主成分的累积贡献率大于85%。本研究中采用累积方差贡献率对不同主成分数进行了分析。结果（图4）表明，主成分数为5 时累积贡献率可达到90%，因此采用5 个主成分计算Hotelling T2。

图4 主成分数对累计贡献率的影响Fig.4 Influence of number of principal components on cumulative contribution rate

配方香精A 的质量监控模型见图5。其中，1～60 号为12 个批次合格样品，61～65 号为加香比例增加5%时感官评吸合格样品。以3σ 为控制上限绘制控制图，由图5 可见，建模样品质量虽略有波动，但总体稳定，T2值均在3σ 控制上限以内。2 个批次待测香精样品（66～75 号）的质量判定结果表明，Hotelling T2值都处于3σ 质量控制限以内，说明香精质量稳定。

图5 模型控制图及待测样品预测Fig.5 Model control chart and predictio n of test samples

2.4.2 模型的应用

针对实际生产过程中可能出现的加香精度差异造成的香气成分含量变化，可以通过该模型进行预测。图6 所示76～80、81～90 号分别为调整加香比例-5%和±10%时感官质量存在显著差异的香精样品，Hotelling T2计算结果均超出控制上限，说明配方香精香气成分相对含量发生改变，该情况完全可以通过该模型进行直观呈现，并且预测结果与感官质量评价结果一致。

图6 异常样品预测Fig.6 Prediction of abnormal samples

为了进一步反映配方香精批次间的差异情况，基于该模型对香精样品的主成分状态进行了分析。图7A 显示，14 个批次合格香精都在置信椭圆内，而异常样品（76～90 号）则偏离较大。批次1和批次2 相较于其他批次略有差异（图7B）。图8中红色和黑色实线分别表示1、2 批次和其余批次香精香气成分含量变化趋势，从A、B、C 区域可以看出，2-甲基丁酸-2-甲基丁酯（11 号）、乙酰丙酸乙酯（29 号）、异丁香酚（65 号）等香气成分出现明显的异常波动，原因可能是1、2 批次样品存放时间超过2 年，其内在香气成分可能发生一定的化学变化，从而影响香精的整体质量，该结果可为过期香精的复检工作提供技术保障。因此，通过监控香气成分变化可以更加客观地反映香精的内在质量，且监测的灵敏度和准确性较高。

图7 烟用香精主成分分析结果Fig.7 Principal component analysis of tobacco flavor

图8 目标香气成分含量变化趋势Fig.8 Variation trend of contents of target aroma components

3 结论

建立了同时测定烟用香精全组分香气成分的GC-MS/MS 分析方法，该方法操作简便、灵敏度高，准确性好，香气成分的检出限一般都小于1.0 ng/mL，日内和日间重复性（RSD）都在3%和5%以内，加标回收率达到80%～120%。GC-MS/MS 分析方法结合基于主成分分析的MSPC 技术，建立的质量监控模型能够快速、准确地从客观上反映烟用香精的内在质量波动情况，可以作为烟用香精质量监控的有效手段。