中药木尼孜其对慢性应激型卵巢早衰大鼠性腺轴的影响*

阿孜古丽·要力瓦斯， 毛吾兰·买买提依明， 迪丽娜孜·艾尔肯， 夏米西努尔·伊力克

(新疆医科大学基础医学院生物学教研室， 新疆 乌鲁木齐 830054)

女性的生殖系统是应激反应的重要系统之一，且易受应激的损害，受到损害后主要表现为月经紊乱、闭经甚至不孕等[1]。随着医学模式向生物-心理-社会模式转变，女性在社会及家庭中的责任及压力日益増加，女性的身心健康受到环境、社会、心理等因素的影响亦越来越凸显，由长期的心理紧张或突发事件导致机体的应激，对女性的生殖损害尤为显著[2-5]。各种身心应激均导致卵巢功能损害，进而发展为卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，常伴有烘热汗出、潮热多汗、胸闷心慌、头晕耳鸣、腰膝酸软、肢体浮肿等绝经前后诸症。POF是指妇女在40岁以前由于各种原因出现持续性闭经，除此之外还伴有卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)及黄体生成素(luteinizing hormone，LH)升高，而雌二醇(estradiol，E2)降低的综合征[6]。因此，探讨慢性应激致性腺轴失调的发病机制，寻找其防治的潜在靶点是目前迫切需要解决的临床难题[7]。

下丘脑-垂体-性腺轴在人类生殖系统神经内分泌功能中起着重要的作用。在女性生殖系统中，下丘脑分泌促性腺激素释放激素，通过调节促性腺激素的分泌，使卵巢功能得以调控[8-9]。卵巢结构的变化可能导致下丘脑-垂体-卵巢轴之间的协调性反应锐减，不能控制性腺轴的正、负反馈作用，因垂体分泌大量的促性腺激素，而卵巢却不能正常分泌性激素，所以血中促性腺激素相对增加[8, 10]。木尼孜其可调节内分泌水平，治疗各种内分泌紊乱引起的妇科炎症和更年期综合征。本研究通过分析卵巢早衰大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的形态学变化，通过Masson染色观察各组大鼠卵巢纤维化程度，初步确认卵巢早衰大鼠的组织形态学病因，再用中药木尼孜其进行干预，确认该药在卵巢早衰大鼠中对性腺轴的改善作用[11]。

材 料 和 方 法

1 实验动物及其分组

通过阴道涂片实验筛选出清洁级2月龄左右的性成熟雌性SD大鼠90只，动物合格证号为SYXK(新)2018-0003，平均体质量为220～240 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，适应性饲养 1周之后，开始进行造模。随机抽取10只为正常对照组(normal组)，其余80只进行 POF造模。

2 主要试剂及仪器

木尼孜其合剂(新疆维吾尔自治区中医院)；Masson染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；E2、FSH和LH ELISA试剂盒(北京北方生物技术研究所)。 RXZ型人工气候箱(宁波市科技园区新江南仪器有限公司)；ZBY-149-83型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；EM-1230型透射式电子显微镜(GATAN)；DM3000型数码显微镜(Leica)。

3 实验方法

3.1慢性应激所致POF模型的建立 模型大鼠置于气候箱中饲养，温度为(7±1)℃，湿度为(85±5)%，在湿寒环境下饲养。在造模过程中，normal组每日给予常规饲料500 g、饮用水500 mL、木屑垫料150 g及正常光照；应激模型组每日给予特殊属性饲料500 g、饮用水500 mL、木屑垫料150 g及正常光照。白天normal组与POF模型动物均随机饮食水，每周选择同一固定时点观测并记录生物学表征如体重、进食量、饮水量、尿量、大便量等并进行统计学分析[11]。

3.2实验分组 正常对照组：放置于常规环境[温度为(20±2)℃，湿度为55%～65%]中饲养，每日随机饮食水。并定时观测各组大鼠生物学表征的变化。

慢性应激POF大鼠的分组及药物干预：建立慢性应激动物模型后，从大鼠眼眶静脉丛进行采血并通过ELISA法检测外周血清中E2、LH及FSH的含量，应激模型组各大鼠激素含量与normal组大鼠激素含量进行比较，并结合应激组各大鼠发情周期的变化筛选出POF模型动物共38只，将其随机分为POF模型组(POF组)、POF药物干预高剂量组(PTH组)、POF药物干预中剂量组(PTM组)和POF药物干预低剂量组(PTL组)；成模后上述药物干预组用中药木尼孜其合剂分高、中、低3种剂量灌胃，其剂量分别为46.86 mL/kg 、23.43 mL/kg和11.72 mL/kg，其中高剂量组与中剂量组分早、晚2次灌胃，药物干预时间为2周。

3.3观察指标 垂体、下丘脑及卵巢组织经固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、烘干等处理，备做HE染色，卵巢组织还备做Masson染色。卵巢指数：将大鼠处死之后速取大鼠双侧卵巢，去除周围多余脂肪组织，用分析天平称重并记录，大鼠卵巢指数(%)=大鼠卵巢湿重/该大鼠体质量×100%。子宫指数：将大鼠处死之后速取大鼠子宫，用分析天平称重并记录，大鼠子宫指数(%)=大鼠子宫湿重/该大鼠体质量×100%。

4 统计学方法

数据处理采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进一步两两比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 卵巢指数

处理取材肉眼发现，POF组卵巢发生水肿且表面伴有黄色脂肪，卵巢组织结构疏松；据统计结果发现，POF组大鼠卵巢指数较normal组大鼠显著增大(P<0.05)；经过药物干预之后， POF模型高、中、低各剂量药物干预组卵巢指数均显著降低(P<0.05)，并且高剂量干预组效果比中、低剂量组更加明显，见表1，提示中药木尼孜其可以有效改善应激所致的卵巢指数的异常改变。

表1 各组大鼠卵巢指数、子宫指数和卵巢胶原纤维面积比的比较

Table 1.The ovary index, uterus index and the area ratio of collagen fibers in the ovary in the rats of each group (Mean±SD)

TreatmentnOvary index(×10-2 mg/g)Uterine index(×10-2 mg/g)Collagen fiber area ratio in ovaryNormal100.431±0.0551.468±0.0739.13±2.47POF100.608±0.055*1.623±0.098*34.61±7.98*PTH90.499±0.053#1.508±0.092#20.20±5.07#PTM100.512±0.049#1.515±0.084#23.71±6.32#PTL90.515±0.071#1.561±0.10130.49±5.02

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPOF group.

2 子宫指数

处死大鼠之后取出子宫发现，POF组子宫发生肿胀，失去其正常形态；据统计结果发现，POF组大鼠子宫指数较normal组大鼠显著增大(P<0.05)；POF模型高、中剂量药物干预组子宫指数均显著降低(P<0.05)，但低剂量组与POF组间的差异无统计学显著性(P>0.05)，见表1，提示中药木尼孜其可以在一定程度上调节应激所致的子宫指数紊乱。

3 HE染色观察下丘脑、垂体和卵巢组织的病理学改变

normal组大鼠的下丘脑间质无水肿，神经元及神经胶质细胞比较丰富，结构清晰，体积均匀；POF组大鼠的下丘脑出现间质水肿(空泡样改变)，神经元核固缩，排列紊乱，神经元及神经胶质细胞数目减少；PTH组神经元丰富，细胞核质分明，结构清晰，偶见神经元坏死，间质出现轻度水肿；PTM组的神经元数目较PTH组少，可见神经元坏死，空泡样改变较多；PTL组的神经元稀少，间质疏松，细胞排列紊乱，见图1。

Figure 1.HE staining of hypothalamus in the rats of each group (×400).

图1 各组大鼠下丘脑的HE染色

normal组大鼠垂体的嗜酸性细胞及嗜碱性细胞数目丰富，血窦数目丰富，基质紧密；POF组大鼠垂体的基质疏松，间质呈空泡样改变，可见出现严重水肿；药物干预之后，PTH组大鼠垂体的嗜酸性细胞数目明显增多，水肿明显好转，排列致密；PTM组大鼠垂体的血窦丰富，嗜酸性细胞增多，基质相对致密；PTL组大鼠垂体以嗜碱性细胞为主，基质比较疏松，偶见血窦，见图2。

normal组大鼠可见卵巢各级卵泡清晰可见，黄体数目较多，颗粒细胞排列整齐，卵泡腔大且卵泡液丰富，偶见闭锁卵泡；POF组大鼠的各级卵泡稀少，可见大量闭锁卵泡，黄体较少，颗粒细胞排列不整齐，部分被纤维组织代替，囊状闭锁卵泡增多，空泡样变化多，说明卵巢水肿严重，间质腺增生且伴有纤维化；经过药物干预，PTH组大鼠出现次级卵泡与初级卵泡，闭锁卵泡数目减少，颗粒细胞较丰富，黄体增多卵泡发育良好；PTM组未见明显次级卵泡，出现脂肪增生，黄体较丰富，间质增生；PTL组大鼠未见各级卵泡，卵泡腔小且颗粒细胞脱落到卵泡液，开始出现黄体，见图3。

Figure 2.HE staining of pituitary in the rats of each group (×400).

图2 各组大鼠垂体的HE染色

Figure 3.HE staining of ovary in the rats of each group (×100).

图3 各组大鼠卵巢HE染色

4 Masson染色观察各组大鼠卵巢的纤维化程度

normal组大鼠主要是卵泡膜以及血管上皮出现纤维化现象，而且纤维化程度较低；POF组大鼠不仅卵泡膜周围出现高度纤维化，而且从黄体膜颗粒渗入到黄体颗粒细胞，纤维化程度高； PTH组大鼠的黄体及间质腺纤维化程度低，卵泡膜以及间质中度纤维化；PTM组卵泡颗粒层以及在间质腺中依然存在纤维化现象，较POF组大鼠其纤维化程度明显降低；PTL组黄体颗粒细胞以及卵泡颗粒层中存在大量纤维化，且胶原纤维从黄体中央开始向四周弥漫扩散，见图4。POF组纤维化程度较normal组大鼠显著升高(P<0.05)；PTH组、PTM组和PTL组大鼠较POF组大鼠纤维化程度分别降低了45.62%、33.49%和14.89%，其中PTH组、PTM组与POF组间差异具有统计学意义(P<0.05)，POF组与PTL组间差异无统计学显著性(P>0.05)，见表1。

Figure 4.Masson staining of ovaries in the rats of each group (×100).

图4 各组大鼠卵巢Masson染色

5 各组大鼠血清中 E2、FSH和LH 水平的变化

与正常对照组比较，模型组大鼠的血清 E2水平明显降低 (P<0.05)，FSH和LH 的水平显著升高(P<0.05); 与POF组比较，各药物干预组的E2水平明显升高，FSH和LH水平显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清激素水平的变化

Table 2.The changes of the serum hormone levels in the rats of each group (Mean±SD)

TreatmentnE2 (ng/L)FSH (U/L)LH (U/L)Normal1049.17±5.872.34±0.673.72±1.13POF1021.09±7.80*8.57±0.89*8.84±1.51*PTH 938.81±6.11#4.14±0.35#4.75±0.45#PTM1033.97±5.56#4.19±0.59#5.45±0.87#PTL 931.97±4.63#5.14±0.76#5.72±1.17#

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsPOF group.

讨 论

应激是机体内环境稳态受到威胁时机体对应激原产生的非特异性反应。现代社会充满了各种应激原，女性在社会中正承担着越来越多的责任及压力，机体常常处于应激状态[12]。临床研究表明拥有过高感知觉压力的女性LH水平降低和FSH水平增高，血清雌二醇和黄体孕激素水平降低，不排卵周期增加。低正性情感能够加速女性卵巢储备的消耗，且慢性心理社会应激原是血清FSH水平的独立相关因素，慢性应激是卵巢储备下降的预测因素[7]。近年来随着研究的深入，应激在下丘脑、垂体，尤其是卵巢水平对卵巢功能的影响机制被进一步揭示，本文探讨下丘脑-垂体-卵巢轴尤其是卵巢的病理生理原因从不同角度研究，为临床改善应激导致的卵巢功能低下提供可能的理论依据[8]。

卵巢早衰是由于多种原因所致卵巢功能衰竭，分泌雌激素的能力下降,因而对性腺轴的负反馈作用减弱,导致垂体分泌的FSH及LH激素水平上升，其中以FSH的上升更为显著[13]。FSH在卵泡发育中起着重要作用，参与卵泡的募集、选择、优势卵泡的发育及成熟各个阶段,这些作用是通过结合受体而完成的。如果产生与受体结合障碍、受体变异、或受体结合后作用障碍，将会导致原发性闭经。POF模型大鼠的外周血E2激素水平降低均显著低于正常对照组，这可能与湿、寒等慢性应激因素影响卵巢的正常结构，各级卵泡数量降低，使得卵巢储备功能降低直接影响卵巢分泌E2使体内激素平衡紊乱导致卵巢早衰。POF模型大鼠的FSH和LH水平显著高于正常对照组，这可能也是一方面在湿、寒环境使垂体的正常结构受到影响的结果，另一方面雌激素之间相互作用通过反馈机制作用于下丘脑，引起FSH、LH等促性腺激素分泌的改变。

本研究通过分析POF大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的形态学变化，通过Masson染色及HE染色观察各组大鼠卵巢形态学变化，初步确认POF大鼠的组织形态学病因，通过中药木尼孜其的药物干预作用，确认其在POF大鼠中对性腺轴的改善作用。在研究中HE染色结果显示POF大鼠下丘脑出现神经胶质细胞大量坏死现象，坏死之后出现间质水肿(空泡样改变)，神经元核固缩，神经元及神经胶质细胞数目减少[14]。其垂体基质疏松，间质呈空泡样改变，可见出现严重水肿，嗜酸性细胞明显减少与此同时嗜碱性细胞明显增多，嗜酸性细胞主要与生长类激素的分泌有关，POF大鼠生长速度较正常组明显降低，这可能与垂体中嗜酸性细胞的减少有一定的关系，同时嗜碱性细胞与促性腺激素的释放有关，说明FSH及LH水平的异常上升可能与垂体中嗜碱性细胞的异常增多有一定关系，其具体机制需进一步研究。POF大鼠卵巢中未见明显初级、次级卵泡，囊状闭锁卵泡增多，空泡样变化多，说明卵巢水肿严重，间质腺增生且伴有纤维化[15]。最后通过Masson染色观察卵巢纤维化程度，结果表明不仅卵泡膜周围出现高度纤维化，而且胶原纤维从黄体膜颗粒渗入到黄体颗粒细胞，纤维化程度高。经过中药木尼孜其的干预，POF大鼠性腺轴相关各组织形态病理学变化得到有效改善，其中高剂量药物干预作用最佳。中药木尼孜其可能通过改善调节女性下丘脑-垂体-卵巢轴各组织的病理学变化，从而进一步调整POF大鼠出现的内分泌紊乱等现象。