下调EZH2表达促进卵巢癌细胞衰老的机制研究*

徐 杨， 彭 慧， 苏雪莲

(济南市第五人民医院妇产科， 山东 济南 250022)

卵巢癌是严重威胁女性健康和生命的三大生殖系统型恶性肿瘤之一。资料显示近年来卵巢癌的发病率呈逐年上升和年轻化趋势，患者的致死率高达85%[1]。缺乏特异性早期诊断指标和治疗抗性是卵巢癌高致死率的主要原因[2]。目前，卵巢癌的治疗方案主要以早期手术切除为主辅以放化疗，但转移性卵巢癌对手术和药物治疗的预后较差[3]。因此，寻找和开发卵巢癌靶向治疗药物迫在眉睫。

组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是PRC2复合物的核心组分，具有甲基转移酶活性，催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)，在多种靶基因启动子上的修饰介导基因表达沉默[4]。研究发现EZH2在前列腺癌、乳腺癌和淋巴瘤中高表达[5-8]，提示EZH2是一个促肿瘤因子，在肿瘤的发生发展中具有重要作用。细胞衰老(cellular senescence)是一种细胞周期的不可逆阻滞，是拮抗肿瘤细胞增殖的程序之一，因此通过诱导细胞衰老来抑制或治疗肿瘤的研究受到重视[9-10]。通过促衰老机制来治疗肿瘤比其它细胞毒性药物对人体的损伤更少，副作用更低[11]。因此，研发诱导细胞衰老的抗肿瘤药在干预肿瘤方面有着广阔的前景。近新研究发现，EZH2介导的H3K27me3与细胞衰老相关[12]；而卵巢癌细胞的放疗耐受与DNA损伤修复和细胞衰老程序的异常密切相关[13]；研究表明EZH2异常表达能抑制卵巢癌细胞衰老，提示EZH2是开发促卵巢癌细胞衰老疗药物的潜在靶点[14]。目前，EZH2促进卵巢癌细胞衰老的遗传学或表观遗传学机制仍不完全清楚。本研究观察EZH2异常表达对卵巢癌细胞衰老的影响，并探讨其作用机制，为以EZH2为靶点开发治疗卵巢癌的新型表观遗传药物提供科学依据。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

1.1标本收集 收集济南市第五人民医院妇产科2012年1月～2018年6月确诊为卵巢肿瘤患者的癌组织35例和良性卵巢囊肿组织41例。所有患者均没有接受放化疗，标本置于液氮中保存。所有患者术前签署知情同意书，并获得本院伦理委员会的批准。

1.2细胞株与试剂 人卵巢癌细胞系Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434以及人正常卵巢上皮细胞IOSE80购自ATCC；DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和双抗购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；改良型RPMI-1640培养基、MTT、DMSO和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自Sigma；GSK126购自ECM；抗EZH2、p53、p21和p16抗体购自Cell Signal Technology；抗Ki67、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP和H3K27me3抗体购自Abcam；抗β-actin抗体购自Santa Cruz；总RNA 提取试剂、逆转录试剂盒(PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)试剂盒(SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ)购自 TaKaRa；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自Thermo。

2 方法

2.1细胞培养 Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434细胞培养于DMEM培养基中；IOSE80细胞培养于RPMI-1640培养基中，培养基均含10% FBS、1%青霉素和1%链霉素，置于37 ℃、5% CO2及完全湿度的培养箱中。当细胞密度为60%～70% 时进行细胞传代。

2.2Real-time PCR 按照TRIzol试剂说明书提取卵巢癌细胞系、癌组织和正常组织的总RNA。按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，反应条件为42 ℃ 2 min、37 ℃ 20 min、85 ℃ 1 min，合成cDNA。取2 ng cDNA进行real-time PCR反应，引物序列见表1。反应条件为95 ℃预变性5 min; 95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。采用SYBR Green Ⅱ荧光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)进行real-time PCR数据分析，结果经β-actin校正，基因相对表达量用 2-ΔΔCt表示。

表1 Real-time PCR引物序列

2.3siRNA合成及细胞转染 针对EZH2基因开放阅读框序列，运用Ambion的网上在线软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)设计EZH2小干扰RNA(EZH2small interfering RNA, siEZH2)，同时设计阴性对照siRNA(negative control siRNA, siRNA-NC)，由Sigma合成。Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434细胞以每孔4×104个接种到6孔板中，细胞密度达到65%左右时进行转染(脂质体2000法)。先用无血清OptiMEM培养液将脂质体2000稀释和配制10 mmol/L siRNA，然后将等体积脂质体2000和siRNA轻轻混匀，室温静置10 min后加入细胞中，培养4 h后换成完全培养基；以转染siRNA-NC为阴性对照。

2.4MTT法测定细胞活力 细胞转染48 h时，以细胞密度为每孔2.5×104个接种96孔板，培养72 h时进行MTT检测；COV434细胞以每孔2.5×104个接种96孔板中培养24 h，弃掉培养基，加入终浓度为20 μmol/L的GSK126，以DMSO处理为对照组，作用72 h时进行MTT实验；加入20 μL 5 g/L的MTT，培养4 h后弃上清，加入150 μL DMSO，轻微振荡使结晶完全溶解，酶标仪测定570 nm处的吸光值(A)值。

2.5集落形成实验 细胞转染48 h时，细胞经消化计数后以每孔1 000个接种于6孔板中培养，直到通过肉眼能清晰观察到可见的细胞集落(>50个细胞)；COV434细胞以每孔1 000个接种于6孔板中培养24 h，弃掉培养基，加入终浓度为20 μmol/L GSK126，以DMSO处理为对照组，每隔3 d补充1次GSK126(终浓度均为20 μmol/L)；弃掉培养基，PBS洗涤，甲醇固定，PBS洗涤，吉姆萨染色，自来水清洗，晾干后计数，按下列公式计算：集落形成率(%)=细胞集落数平均值/铺板细胞数×100%。

2.6流式细胞术 COV43细胞经终浓度为20 μmol/L GSK126或DMSO作用72 h时收集细胞；细胞转染72 h时用PBS洗涤，胰酶消化、离心收集细胞，按照Annexin-V/PI试剂盒说明书操作，先加入500 μL的binding buffer重悬细胞，再加入5 μL FITC标记的Annexin-V和5 μL PI混匀，室温下避光孵育15 min，运用流式细胞仪测定细胞凋亡。

2.7电离辐射照射和SA-β-Gal染色 IOSE80细胞以每孔3 000个接种于6孔板，培养24 h时进行siRNA转染，培养48 h时经5 Gy电离辐射照射；将6孔板用封口膜封好，转移至X射线辐照仪中照射，剂量率为0.36 Gy/min；电离辐射照射后72 h时按照试剂盒说明书操作进行β-Gal染色；显微镜下观察并拍照，随机选择20个视野计数，取平均值，计算SA-β-Gal染色阳性细胞率。

2.8Western blot实验 siRNA转染的Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434细胞48 h时收集细胞。siRNA转染的IOSE80细胞培养48 h时细胞经5 Gy电离辐射照射培养72 h时收集细胞。COV434细胞经终浓度为20 μmol/L GSK126或DMSO作用72 h时进行5 Gy电离辐射，电离辐射后再补充1次GSK126，培养48 h后收集细胞。加入RIPA细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS)，超声破碎、12 000×g，4 ℃离心15 min，BCA法测定蛋白浓度；以20 μg蛋白进行SDS-PAGE，将蛋白转移到硝酸纤维膜上，10%脱脂奶粉封闭，孵育 I 抗(EZH2、p53、p21、p16、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase 9、 cleaved caspase 9、H3K27me3、H3K27me2、H3K27me1和β-actin)，4 ℃过夜。洗膜、孵育HRP-IgG II 抗，室温1 h。ECL显影后扫描，再用Quanity-One软件分析。

2.9免疫组织化学染色和观察 收集的卵巢癌组织及癌旁组织经4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋和切片。将组织切片固定，脱蜡，乙醇脱水，3% H2O2处理除去内源性过氧化氢酶，0.01 mol/L柠檬酸缓冲液进行抗原修复，孵育 I 抗(EZH2和Ki67)，洗片，孵育 II 抗，洗片，DAB显色，封片待观察。显微镜下观察拍照，采用Image-Pro Express 6.0数码成像系统软件拍照分析。

3 统计学处理

实验进行3次独立重复实验。采用SPSS 17.0统计软件进行相关数据分析，结果用均值±标准差(mean±SD)表示，两组之间的比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 EZH2在卵巢癌组织和细胞中的表达水平

Real-time PCR结果显示EZH2在卵巢癌组织中的mRNA表达水平显著高于正常组织(P<0.01)，见图1A；免疫组织化学染色结果进一步证实EZH2蛋白在卵巢癌组织中呈强阳性染色，而在癌旁组织呈EZH2阴性或弱阳性染色，见图1B；同样，4种卵巢癌细胞中的EZH2的mRNA和蛋白水平显著高于IOSE80细胞(P<0.05)，见图1C、D；EZH2的催化产物H3K27me3的水平也明显增高(P<0.05)，见图1D。这些结果提示EZH2的表达水平与卵巢癌的发生发展相关。

Figure 1.The expression levels of EZH2 in the ovarian cancer tissues and cells. A: real-time PCR was used to detect EZH2 mRNA expression in the ovarian cancer tissues and normal tissues; B: immunohistochemical staining was used to detect EZH2 protein expression in ovarian cancer (n=35) and normal (n=41) tissues; C: the mRNA expression of EZH2 in the ovarian cancer cells and IOSE80 cells was detected by RT-qPCR; D: the results of Western blot for detecting EZH2 protein expression and H3K27me3 level in the ovarian cancer cells and IOSE80 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsnormal tissues;**P<0.01vsIOSE80 cells.

图1 EZH2在卵巢癌组织和细胞中的表达水平的比较

2 EZH2低表达对卵巢癌细胞增殖的影响

与siRNA-NC组细胞比较，siEZH2介导Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434细胞中的EZH2低表达，同时H3K27me3的水平也明显降低，但H3K27me2和H3K27me1水平无明显变化，见图2A；EZH2在4种卵巢癌细胞中的表达水平均显著降低(P<0.01)，见图2B；MTT实验结果显示，与对照组比较，干扰EZH2表达显著抑制4种卵巢癌细胞的活力(P<0.01)，见图2C；免疫组织化学染色结果表明Ki67(细胞增殖的标志物)在卵巢癌组织中的表达水平显著高于正常组织，见图2D。集落形成实验结果显示，干扰EZH2的表达减少4种卵巢癌细胞的集落形成(P<0.01)，见图3A、B；EZH2的甲基转移酶抑制剂GSK126也能抑制卵巢癌细胞的集落形成(P<0.01)，见图3A、C，其作用与干扰EZH2的表达类似。以上结果表明EZH2是一个肿瘤促进因子，其高表达能促进卵巢癌细胞增殖，且EZH2促进细胞增殖是通过H3K27me3发挥作用的。

3 EZH2低表达对卵巢癌细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示，EZH2低表达或GSK126作用对4种卵巢癌细胞凋亡无影响，与对照组比较差异无统计学显著性(P>0.05)，见图3D、E。

4 EZH2低表达对正常卵巢上皮细胞衰老的影响

干扰EZH2的表达明显升高电离辐射诱导的IOSE80细胞 SA-β-Gal阳性率，具有时间依赖关系，见图4A。统计分析结果显示，EZH2低表达的细胞SA-β-Gal阳性率显著高于siRNA-NC组细胞(P<0.01)，见图4B。Real-time PCR结果显示，与对照组比较，干扰EZH2的表达显著促进p16和p21的mRNA表达，具有时间依赖关系(P<0.01)，见图4C、D。上述结果表明抑制EZH2介导的H3K27me3水平可促进细胞衰老，进而抑制卵巢癌细胞增殖。

5 EZH2低表达对细胞增殖信号通路的影响

Western blot结果显示，在IOSE80细胞中干扰EZH2表达明显激活p53及其下游靶基因p21的表达，同时细胞衰老通路重要标志物p16的表达水平也被明显激活；电离辐射照射激活p53、p21及p16的蛋白表达，而干扰EZH2能明显抑制电离辐射诱导的p53、p21及p16表达(P<0.01)，见图5A、C。相同条件下，下调EZH2对caspase-3和PARP的蛋白水平无影响，提示抑制EZH2表达不能激活细胞凋亡通路，见图5A、E，与流式细胞术分析的结果相一致。我们用H3K27me3抑制剂GSK126作用COV434细胞后，同样发现GSK126呈剂量依赖性抑制EZH2和H3K27me3的水平，但对H3K27me2和H3K27me1的水平无影响，见图5B、D、F。同时，GSK126能激活p53和p16蛋白表达，具有剂量依赖关系，但对caspase 通路无影响，见图5B、D、F。上述结果表明抑制EZH2表达通过降低H3K27me3水平，激活p53和p16通路而诱导细胞衰老。

Figure 2.The effect ofEZH2 expression knock-down on the viability and the expression of proliferation marker Ki67 in the ovarian cancer cells. A: siEZH2 transfection mediated the low expression of EZH2 in ovarian cancer cells; B: the quantitative analysis of EZH2 protein expression in ovarian cancer cells; C: MTT assay was used to detect the viability of ovarian cancer cells; D: the quantitative analysis of Ki67 protein expression in ovarian cancer (n=35) and normal tissues (n=41). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

图2 敲减EZH2表达对卵巢癌细胞活力和增殖分子表达的影响

Figure 3.The effect ofEZH2expression knock-down on colony formation and apoptosis of ovarian cancer cells. A: colony formation test to detect the colony formation ability of ovarian cancer cells; B and C: quantitative analysis of ovarian cancer cell colony formation rate; D and E: quantitative analysis of ovarian cancer cell apoptosis rate. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

图3 下调EZH2表达对卵巢癌细胞集落形成能力和细胞凋亡的影响

Figure 4.The effect ofEZH2expression knock-down on the senescence of IOSE80 cells after 10 Gy of ionizing radiation (IR). A: SA-β-Gal staining was used to detect cellular senescence (×10); B: quantitative analysis of SA-β-Gal positive rate of IOSE80 cells; C and D: real-time PCR was used to detected p21 and p16 mRNA expression in IOSE80 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

图4 EZH2低表达对电离辐射后正常卵巢上皮细胞衰老的影响

讨 论

多梳蛋白(Polycomb-group proteins, PcG)复合物由多梳蛋白抑制复合物1(Polycomb repressive complex 1, PRC1)和PRC2组成[15]，EZH2是PRC2的核心组成成分，是PcG家族成员中唯一具有甲基转移酶功能的表观遗传沉默子，EZH2与靶基因启动子区域结合介导H3K27me3的修饰，沉默靶基因的表达[16-17]。研究表明EZH2介导的H3K27me3水平在多种肿瘤发生发展中具有重要作用[5-8]。EZH2和H3K27me3在原发性肝细胞癌中高表达，与其不良预后呈正相关，可作为肝细胞癌早期诊断的生物标志物[18-19]。然而EZH2在卵巢癌中的生物学功能尚不完全清楚。本研究运用real-time PCR、免疫组化及Western blot从mRNA和蛋白水平对卵巢癌组织样本进行EZH2表达水平的检测，发现EZH2在卵巢癌组织中高表达，提示EZH2表达水平与卵巢癌发生发展密切相关。同时本研究在细胞水平进一步证实EZH2和H3K27me3在4种卵巢癌细胞中高表达，与文献报道EZH2及H3K27me3在其它肿瘤组织中高表达相符[5-8]。

本研究进一步探讨了EZH2和H3K27me3高表达对卵巢癌细胞恶性表型的影响，结果发现干扰EZH2表达明显降低H3K27me3的水平，而对H3K27me2和H3K27me1水平无影响，说明H3K27me3是EZH2的特异性催化底物。同时干扰EZH2显著抑制4种卵巢癌细胞增殖和集落形成，EZH2甲基转移酶活性抑制剂GSK126对细胞增殖的抑制作用与干扰EZH2的表达类似，说明下调EZH2表达抑制卵巢癌细胞增殖是通过降低H3K27me3水平而实现，相同条件下干扰EZH2对细胞凋亡无明显影响。研究表明EZH2非特异性抑制剂DZNep通过激活DNA损伤应答通路诱导肝细胞癌细胞凋亡[20]，与本研究结果不符。这可能与肿瘤类型以及药物靶向性不高有关，因为DZNep具有非依赖于EZH2的生物学功能[21]。同时我们在卵巢癌组织水平也发现Ki67(细胞增殖的标志物)在卵巢癌组织中高表达，证实EZH2介导的H3K27me3水平能促进卵巢癌细胞的恶性表型。

Figure 5.The effect ofEZH2expression knock-down on the protein levels of cell proliferation- and apoptotic signaling pathway-related molecules in the ovarian cancer cells. A: Western blot images of the proteins in IOSE80 cells 3 and 6 d after 5 Gy of ionizing radiation (IR); B: Western blot images of the proteins in COV434 cells treated with GSK126 3 d after 5 Gy of IR; C and E: the quantitative analysis of A; D and F: the quantitative analysis of B. Mean±SD.n=3.*P<0.01vssiRNA-NC group;#P<0.05vs0 μmol/L group.

图5 下调EZH2表达对卵巢癌细胞增殖和凋亡信号通路相关分子蛋白水平的影响

研究发现EZH2通过表观遗传机制沉默多种肿瘤抑制因子的表达促进肿瘤的发生，如miR-139-5p、miR-125b、miR-101、let-7c和miR-200b[22]；干扰EZH2表达通过抑制细胞自噬逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐受[23]。SA-β-Gal染色结果发现干扰EZH2表达明显促进电离辐射诱导的细胞衰老，同时细胞周期阻滞因子p21和细胞衰老标志物p16的转录水平显著增加，说明EZH2通过调控细胞衰老通路而不是细胞凋亡通路促进细胞恶性表型。我们用Western blot实验证这一假设，结果发现下调EZH2表达能激活p53及下游信号通路以及细胞衰老p16通路，对细胞凋亡通路如caspase 3和PARP通路无影响。本研究发现EZH2在卵巢癌组织中高表达，EZH2通过调控细胞衰老通路促进卵巢癌细胞恶性表型。因此EZH2可作为一种新的卵巢癌诊断标志物及研发表观遗传药物的靶点。