神经胶质瘤患者血浆外泌体lncRNA LINC00511的表达及意义

王 博 王亚周 王 凯 靳腾龙 崔丙周 贺艳阳

郑州人民医院神经外科，河南 郑州 450003

神经胶质瘤是神经系统常见的脑部恶性肿瘤，占颅内肿瘤的45%，颅内恶性肿瘤的80%，发病率及病死率居中枢神经恶性肿瘤首位[1]。其细胞呈浸润生长，且与正常脑组织界限不明显，发病率高、病程短、病死率高、易复发及治愈率低[2]。目前神经胶质瘤治疗以外科手术结合放化疗为主，患者症状在短期内得以改善，但残留病灶易复发，预后较差[3]。因此，寻找与神经胶质瘤发生发展相关基因，对患者制定个体化治疗方案及预后评估极为关键。近年来，有关研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可通过调控多种途径参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移[4]。lncRNA LINC00511为lncRNA的一种，有研究发现其在非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠腺癌等恶性肿瘤中异常表达，并参与肿瘤发生发展[5-7]。外泌体是一种微小囊泡，参与多种生理病理过程，有研究证实外泌体参与神经胶质瘤致病过程，在其诊断与治疗中发挥重要作用[8-9]。本研究旨在探讨神经胶质瘤患者血浆外泌体lncRNA LINC00511的表达水平及临床意义，为其治疗及预后评估提供新思路。

1 资料与方法

1．1一般资料选取2013-01-2014-04郑州人民医院收治的82例神经胶质瘤患者为研究对象，选取同期80例体检健康者为对照组，纳入标准：(1)病理学确诊为神经胶质瘤者；(2)临床资料和随访记录完整；(3)所有患者知情并签署知情同意书；(4)经本院伦理委员会审查批准。排除标准：(1)神经胶质瘤复发者；(2)有手术、放化疗史者；(3)生存时间<6个月者；(4)伴严重代谢性疾病者；(5)合并其他恶性肿瘤者；(6)合并其他中枢神经系统疾病者；(7)有中枢神经系统疾损伤史者。其中男44例，女38例；年龄28～72(55.24±4.68)岁；病理类型：星形细胞瘤35例，间变星形细胞瘤21例，胶质母细胞瘤16例，间变少突星形细胞瘤10例；WHO分级[10]：Ⅰ～Ⅱ级35例，Ⅲ～Ⅳ级47例；KPS评分：≤80分37例，>80分45例。对照组男41例，女39例；年龄26～73(54.19±4.45)岁。2组患者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1．2试剂与仪器血浆外泌体提取试剂盒(Life Technologies，美国)，Trizol(Invitrogen，美国)，逆转录试剂盒(Takara，日本)，SYBR premix ex taq试剂盒(Takara，日本)，普通PCR仪(ABI，美国)，7500荧光定量PCR仪(ABI，美国)，7500 Real Time PCR System(ABI，美国)，ST16R低温高速台式离心机(Thermo，美国)，lncRNA LINC00511、ACT引物(Invitrogen，美国)。

1．3方法(1)血浆外泌体提取，参照外泌体提取试剂盒说明书进行操作，并通过100 g/L的PAGA凝集检验。(2)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测受试者血浆外泌体lncRNA LINC00511水平，取待检血浆外泌体，加入Trizol裂解提取总RNA；配制10 μL cDNA反应体系，反应条件：42 ℃ 60 min、70 ℃ 10 min；配制20 μL qRT-PCR反应体系，反应条件：90 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min、95 ℃ 5 s、60 ℃ 25 s、65—95—65 ℃ 30 min，40个循环，进行荧光检测，采用2-△△CT方法计算血浆外泌体lncRNA LINC00511相对表达量，实验步骤由同一人严格按照试剂盒说明书操作，引物序列见表1。

2 结果

2．1不同受试者血浆外泌体lncRNALINC00511表达WHO Ⅲ～Ⅳ级、Ⅰ～Ⅱ级神经胶质瘤患者血浆外泌体lncRNA LINC00511水平明显高于对照组(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ级患者高于Ⅰ～Ⅱ级患者(P<0.05)。见表2。

2．2血浆外泌体lncRNALINC00511表达与临床病理参数的关系以lncRNA LINC00511在神经胶质瘤血浆外泌体中的表达平均数3.12为界，将患者分为高表达组(n=44)与低表达组(n=38)，lncRNA LINC00511与患者WHO分级、KPS评分相关(P<0.05)，而与年龄、性别、肿瘤直径、侵犯脑叶数无关(P>0.05)。见表3。

表1 qRT-PCR扩增引物序列

表2 不同受试者血浆外泌体lncRNA LINC00511表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与WHOⅠ～Ⅱ级比较，#P<0.05

表3 lncRNA LINC00511表达与神经胶质瘤临床病理参数的关系

2．3血浆外泌体lncRNALINC00511表达与神经胶质瘤患者预后的关系采用Kaplan-Meier绘制lncRNA LINC00511低表达与高表达生存曲线，采取Log-Rank检验，lncRNA LINC00511高表达组生存率为34.09%(15/44)，低表达组生存率为65.79%(25/38)，2组生存率比较差异有统计学意义(P<0.05)；lncRNA LINC00511高表达组中位数生存时间为(42.00±3.60)个月，明显低于低表达组的(51.00±6.07)个月(P<0.05)。见图1。

2．4神经胶质瘤患者预后的影响因素分析单因素分析显示，WHO分级、KPS评分、lncRNA LINC00511是影响神经胶质瘤患者预后的风险因素；多因素COX比例分析显示，高表达水平的lncRNA LINC00511、高WHO分级及KPS评分≤80分是影响神经胶质瘤患者预后的独立危险因素。见表4。

3 讨论

神经胶质瘤是一种中枢神经系统原发性肿瘤，侵袭力极强，具有无限增殖能力，尤其浸润性生长，手术时难以准确定位肿瘤边界，增加手术难度，导致术后常出现残留病灶复发，预后差，特别是胶质母细胞瘤患者预后生存期极短[11-12]。神经胶质瘤具有高度异质性，放化疗药物无法对其进行精准定位，导致肿瘤细胞对放化疗产生高耐受性[13-14]。因此，探寻基因与细胞上参与神经胶质瘤致病机制，成为医学研究的热点。

图1 生存曲线图Figure 1 Survival curve

变量单因素分析多因素分析HR95%置信区间P值HR95%置信区间P值年龄(<50岁 vs ≥ 50岁)1.0810.714～1.6370.4211.0460.672～1.6280.508性别(男 vs 女)0.7040.395～1.2530.7160.8050.452～1.4330.645肿瘤直径(<4 cm vs ≥4 cm)1.2960.824～2.0380.2351.1220.694～1.8150.284WHO分级(Ⅰ～Ⅱ级 vs Ⅲ～Ⅳ级)2.1111.136～3.9240.0152.4201.382～4.2370.009KPS评分(≤80分 vs >80分)2.3311.239～4.3850.0102.8811.476～5.6250.000侵犯脑叶数(<2个 vs ≥ 2个)1.1440.675～1.9390.3820.8570.621～1.8130.524lncRNA LINC00511(低表达vs高表达)2.1611.375～3.3960.0132.5311.532～4.1830.005

lncRNA过去被认为是基因“垃圾”，近年来大量研究证实其具有复杂的生物学功能，通过抑制mRNA降低、调节蛋白活性及改变相关蛋白编码基因等，参与细胞增殖、凋亡、分化及疾病的发生[15-17]。有研究报道，lncRNA在神经胶质瘤发生发展中发挥重要作用；WANG等[18]研究发现，lncRNA HOXA11-AS在胶质瘤中过表达能促进肿瘤细胞增殖，其表达敲低能通过调节细胞周期进程抑制细胞增殖，并与胶质瘤分级和预后密切相关。GAO等[19]研究发现，lncRNA ZFAS1在胶质瘤组织与细胞系中均高表达，体外lncRNA ZFAS1抑制可明显抑制胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭，并通过调节上皮-间质转化和Notch信号途径参与致癌过程。lncRNA LINC00511是近几年新发现的lncRNA，已有研究报道lncRNA LINC00511在一些肿瘤疾病中异常表达[20]。ZHAO等[21]研究发现，LINC00511在胰腺导管腺癌组织中表达上调，并与预后相关，其通过调控hsa-miR29b-3p的竞争性内源RNA活性上调血管内皮生长因子A表达，参与胰腺导管腺癌发生发展。本研究显示，WHO Ⅲ～Ⅳ级、Ⅰ～Ⅱ级神经胶质瘤患者血浆外泌体LINC00511水平明显高于对照组，Ⅲ～Ⅳ级患者高于Ⅰ～Ⅱ级患者，与LI等[22]研究结果相似，提示血浆外泌体lncRNA LINC00511在神经胶质瘤患者血浆外泌体中表达上调，并随肿瘤恶性程度升高而升高，在神经胶质瘤中可能作为致癌基因存在。WHO分级是根据神经胶质瘤恶性程度分为Ⅰ～Ⅳ级，Ⅰ～Ⅱ级为分化良好的低级胶质瘤，Ⅲ～Ⅳ级为低分化的恶性肿瘤，预后较差，而KPS评分是对患者功能状态进行评分，分数越高患者健康状况越好，对治疗时带来的不良反应耐受力越高[23-25]。进一步研究显示，lncRNA LINC00511与患者WHO分级、KPS评分相关，提示血浆外泌体lncRNA LINC00511可能参与神经胶质瘤发生、发展。神经胶质瘤为高度异质性肿瘤，不同亚型胶质瘤生物学特性存在较大差异，可能是本研究样本量少，导致未发现血浆外泌体lncRNA LINC00511表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、侵犯脑叶数之间的关系。通过Kaplan-Meier分析显示，lncRNA LINC00511高表达组生存率明显低于低表达组，高表达组中位数生存时间明显低于低表达组，与DING等[26]研究结果相似，提示血浆外泌体lncRNA LINC00511高表达患者中位数生存期短，预后较差，可能成为神经胶质瘤治疗的新靶点及预后评估的潜在生物标记物。最后通过单因素、多因素COX比例分析显示，高表达水平的lncRNA LINC00511、高WHO分级及KPS评分≤80分是神经胶质瘤患者预后不良的危险因素，进一步提示血浆外泌体lncRNA LINC00511与神经胶质瘤患者预后密切相关。

lncRNA LINC00511在神经胶质瘤患者血浆外泌体中高表达，与WHO分级、KPS评分相关，血浆外泌体lncRNA LINC00511高表达患者预后较差，是影响预后的危险因素。本研究尚存一些不足，如病例数量少，为单中心研究，关于血浆外泌体lncRNA LINC00511与神经胶质瘤的内在具体机制目前尚不明确，还需进一步验证。