吉医胶囊(SAOG)对CTX 致免疫低下小鼠的免疫增强作用

李正祎,王 月,王 瑶,于佳卉,张宸豪

(1.吉林医药学院检验学院,吉林 吉林132013;2.北华大学药学院,吉林 吉林132013)

吉医胶囊(暂用名)是基于中医理论对免疫低下疾病的认识,结合中药理论组合而成的中药复方,主要用于调节人的免疫功能。此复方中药由北五味子、黄芪、麦冬、人参(Schisandra,Astragalus,Radix Ophiopogonis,Ginseng,SAOG),按原药1∶5∶2∶1组成,北五味子、黄芪、麦冬提取多糖,人参提取皂苷。五味子药食同源,多糖含量丰富,具有明显的免疫调节作用[1]。黄芪是治疗气虚的常用中药,有“补气升阳之王”的美誉,大量研究报道了黄芪多糖对免疫功能的调节和增强作用,且涉及到特异性和非特异性免疫等诸多方面[2]。麦冬多糖为麦冬发挥增强免疫作用的有效部位,除药用外,麦冬作为保健饮品和功能性食品也受到了国际保健食品界的青睐[3]。人参皂苷可作用于机体的免疫器官、免疫细胞和免疫分子,提高机体非特异性免疫和特异性免疫功能[4]。

一定剂量的环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)对机体免疫系统有一定损害,被广泛应用于建立动物免疫抑制模型[5]。本试验根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册(2003 版)》“增强免疫力功能评价方法”[6],采用CTX 制备免疫低下小鼠模型,观察SAOG 对CTX 致小鼠免疫低下的保护作用及其增强免疫的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料 SPF 级6~8 周龄,雄性ICR 小鼠,体质量18~22 g,由长春亿斯实验动物技术有限公司提供,实验动物生产许可证号:SCXK(吉)2016-0003。

北五味子,购自吉林省集安市五味子种植基地;黄芪、麦冬和人参,购自安图市安兴中药饮片有限公司;北五味子多糖、黄芪多糖、麦冬多糖,人参皂苷均由北华大学药理教研室协助提取;IL-2 试剂盒、IFN-γ、TNF-α 试剂盒,均购自杭州联科生物技术股份有限公司;刀豆蛋白(ConA),购自美国Sigma公司;CCK-8,购自碧云天生物技术有限公司;CTX,购自江苏盛迪药业有限公司;印度墨汁,购自上海锐永生物科技有限公司;Annexin-v-FITC/PE 凋亡试剂盒,购自天津三箭生物技术有限公司;Na2CO3,购自广州化学试剂厂。

Epics-XL 流式细胞仪,美国Beckman Coulter 公司;Infinite M200 酶标仪,瑞士Tecan 公司;722N 可见分光光度计,上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 吉医胶囊的制备 本文所用的北五味子多糖、黄芪多糖、麦冬多糖的提取方法为水提醇沉法。大致的制备过程如下:用蒸馏水回流提取2 次后,收集滤液;浓缩滤液,加入乙醇至酒精浓度为90%,过夜;收集沉淀,干燥即得。人参皂苷采用回流提取法提取[7]。将上述所得混匀制成胶囊,试验用混合物保存在-20 ℃,用前生理盐水溶解。

1.2.2 动物分组、造模及给药 将动物随机分为10 组,设对照组(Contral group,CON)、免疫抑制模型组(Model group,MOD)、吉医胶囊低、中、高(SAOG-L、M、H)剂量组(剂量分别为0.4、0.8、1.6 mg/10 g·bw),每组各10 只小鼠。各组均按10 mL/kg·bw 灌胃给药,每天1 次,连续21 d;对照组和免疫抑制模型组灌胃等体积生理盐水。除对照组外,其他各组在给受试物第17 天开始腹腔注射环磷酰胺(20 mg/kg·bw·d),连续5 d,末次注射后24 h 采血并剖检测定各项指标;ICR 鼠一半用于碳粒廓清试验。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 鼠外周血白细胞的测定 给药第22 天(末次给予CTX 第1 天),小鼠摘眼球采血,EDTA抗凝,用手工法测定白细胞总数。方法:取小鼠鲜血10 μL 于490 μL 2%冰乙酸中,轻轻混匀,取1 滴于血球计数板上10 倍物镜下计数。

1.2.3.2 SAOG 对小鼠免疫器官重量的影响 称量各组小鼠体质量,脱颈椎处死小鼠。取其胸腺和脾脏,剪去脂肪和筋膜组织称量胸腺和脾脏质量,计算脏器指数。脏器指数=脏器质量(mg)/体重(g)。随后,用10%福尔马林溶液固定胸腺和脾脏,将病理标本切片用H.E.染色。在光学显微镜下(放大倍数为400 倍)观察病理变化。

1.2.3.3 脾淋巴细胞凋亡检测 无菌条件下剥离脾脏,分别碾碎,置于200 目过滤网过滤,弃去细胞碎片,制成脾细胞悬液。 PBS 清洗2 次,用1×Binding Buffer 调节细胞至106~107个/mL,取细胞100 μL 于流式 管 中,加10 μL Annexin-VFITC 冰上混匀,避光15 min,再加1×Binding Buffer 380 μL,再加10 μL PI,进行流式细胞仪(FCM)检测。

1.2.3.4 脾淋巴细胞增殖检测 将上述试验中部分单细胞脾脏悬液浓度调整为2×106/mL。每份悬液分2 孔加入24 孔培养板中,每孔1 mL,其中一孔加50 μL(5 μg/mL),另一孔不加ConA 作为对照。孵育72 h,每孔加入40 μL CCK-8 后4 h 用450 nm 波长检测,计算脾淋巴细胞增殖率。淋巴细胞的转化能力=加入ConA 孔的A 值-不加入ConA 孔的A 值。

1.2.3.5 血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 水平检测 将小鼠摘除眼球取血后,离心取上清液。采用ELISA 法检测各组小鼠血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 水平,具体操作根据试剂盒说明书进行。采用全波长酶标仪检测450 nm 波长处OD 值,绘制标准化曲线。

1.2.3.6 小鼠碳廓清试验 从小鼠尾静脉注入50%稀释的印度墨汁,按每10 g 体质量0.1 mL 计算。待墨汁注入,立即计时。测定注入墨汁后3(A3)、11 min(A11),分别从内眦静脉丛取血20 μL,并立即将其加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。用分光光度计或全自动酶标仪在600 nm 波长处测光密度A 值,以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死,取肝脏和脾脏,用滤纸吸干脏器表面血污,称量质量。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数α。

α=体质量/(肝质量+脾质量)×K1/3

K=(LogA3-LogA11)/(t11-t3)

1.3 数据处理 采用SPSS 19.0 统计软件进行处理,所有数据以均数±准差(X±s)表示。经t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义;P<0.01 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 SAOG 对小鼠脏器指数的影响 由表1 可知,在腹腔注射CTX 之后,最终体重模型组与空白组相比小鼠的体重出现很大程度的降低,表明该模型是成功的;与模型组比较,对照组、SAOG-L/M 组小鼠体质量差异有统计学意义(P<0.05),对照组、SAOG-L/M 组小鼠之间体质量差异无统计学意义(P>0.05);SAOG-H 组与模型组比较小鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,模型组的胸腺指数和脾脏指数均有明显的降低,CTX引起小鼠免疫器官萎缩,造成严重的免疫抑制,表明造模是成功的。与模型组相比,不同剂量SAOG对胸腺、脾脏均有明显的恢复作用(P<0.05),均可以大幅度提高小鼠的胸腺/脾脏指数。因此,SAOG对CTX 造成的免疫器官抑制有一定的恢复作用,而且以低剂量对胸腺和脾脏的恢复作用更明显,但不同剂量组之间的差异并不明显。

2.2 SAOG 对小鼠白细胞总数的影响 小鼠白细胞正常范围为(4~12)×109个/L[8]。由图1 可知,模型组小鼠的白细胞个数明显低于正常范围。各SAOG 组的白细胞总数较模型组都有明显增长(P<0.05),但不同剂量SAOG 组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 SAOG 对小鼠脏器指数的影响

图1 SAOG 对小鼠白细胞总数的影响

2.3 SAOG 对CTX 致免疫低下小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的影响 不同剂量组的SAOG 对CTX 致免疫低下小鼠脾淋巴细胞凋亡的影响如图2 所示,结果表明,与对照组相比,模型组早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均显著增加(P<0.01);与模型组相比SAOG中、高剂量组的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均显著下降(P<0.01),低剂量组的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率呈明显下降(P<0.05)。

2.4 SAOG 对CTX 致免疫低下小鼠T 淋巴细胞增殖能力的影响 结果用加入和不加ConA 的光密度值的差值来表示脾脏淋巴细胞的增殖能力。若差值越大,则表示增殖能力越强。SAOG 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响如表2 所示,结果表明,各试验组小鼠脾淋巴细胞转化值(ConA+与ConA-吸光度差值)均高于模型组,且存在剂量-反应关系,随SAOG 剂量的增加呈上升趋势。

2.5 SAOG 对CTX 致免疫低下小鼠碳廓清试验的影响 结果如图3 所示,与对照组比较,模型组吞噬指数α 显著降低(P<0.01)。与模型组比较,SAOG高剂量组吞噬指数α 明显升高(P<0.05)。SAOG低/中剂量组吞噬指数α 虽与模型组比较无统计学差异,但呈上升趋势。

图2 SAOG 对小鼠脾淋巴细胞凋亡的影响

表2 混合物对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响

2.6 SAOG 对CTX 致免疫低下小鼠血清中细胞因子的影响 如图4 所示,通过ELISA 法检测血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 浓度,与对照组相比模型组IL-2、TNF-α、IFN-γ 浓度均明显降低(P<0.05);与模型组比较,SAOG-H 组IL-2 浓度明显增高(P<0.05)。SAOG-M/H 组TNF-α,SAOG-H 组IFN-γ 浓度明显增高(P<0.05)。

2.7 SAOG 对CTX 致免疫低下小鼠脾、胸腺病理形态学的影响 为进一步了解SAOG 对CTX 致免疫低下小鼠免疫器官的影响作用,行脾、胸腺组织形态学观察,组间比较结果如下:如中插彩版图5、图6脾组织切片所示:对照组小鼠脾组织脾小体形态和数量正常,白髓区界限较清晰,白髓区的淋巴细胞排列致密,淋巴滤泡结构清晰可见;红髓区富含充有红细胞的血窦。模型组脾组织脾小体数量明显减少,体积明显减小,呈萎缩状态,红髓和白髓分界不清。SAOG-L 组脾组织白髓区淋巴细胞数量未见明显减少,脾小体数量略有减少。SAOG-M/H 组脾组织红髓和白髓界限分明,皮质形态大小接近正常,未见有明显的病理学损伤。

图3 SAOG 对小鼠吞噬指数α 的影响

对照组胸腺内可见小叶内梁,胸腺皮质大小形态正常,每个皮质内可见髓质,髓质结构清晰。与对照组相比,模型组胸腺皮质淋巴细胞减少,未聚集成结节状,髓质与皮质分界不清,髓质数量减少。与模型组相比,SAOG-H 组和SAOG-M 组皮质与髓质分界清晰,皮质形态大小恢复正常,SAOG-L 组皮层和髓质分界不清晰,但略好于模型组。

3 讨论

图4 血清IL-2、IFN-γ、TNF-α 浓度检测

本试验通过连续5 d 腹腔注射CTX(20 mg/kg·bw)建立免疫抑制模型,研究吉医胶囊(SAOG)对免疫抑制小鼠各个免疫指标的调节效应。单独将模型组与空白组相比可以发现,模型组的体重、免疫器官指数、外周血白细胞数、巨噬细胞的吞噬能力、细胞因子水平等均存在显著差异,说明免疫抑制模型造模较成功。而与模型组相比,SAOG 能够将CTX致免疫低下组小鼠的体重、免疫器官指数、外周血白细胞数、巨噬细胞的吞噬能力、细胞因子等免疫指标恢复到接近正常水平。这些数据说明,SAOG对免疫抑制小鼠的免疫功能具有恢复作用。

图5 各组小鼠脾组织H.E.染色结果 (×400)

图6 各组小鼠胸腺组织H.E.染色结果 (×400)

非特异性免疫是机体免疫系统的重要组成部分,单核-巨噬细胞能对外来异物进行识别和清除,单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一,吞噬率可以反映机体非特异性免疫功能的强弱[9]。本试验结果表明,SAOG 能促进小鼠巨噬细胞的吞噬能力,尤以SAOG-L 组增加明显,具有统计学意义,提示SAOG 能显著增强小鼠非特异性免疫功能。胸腺和脾脏是重要的免疫器官,其脏器指数可以在一定程度上反应机体免疫功能的强弱。试验组胸腺、脾脏与模型相比质量均增大,并随剂量增大作用增强,差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01),表明SAOG 能够促进小鼠胸腺、脾脏细胞的增殖,增加小鼠抗体生成器官脾脏及胸腺的重量,提高小鼠的胸腺指数和脾指数。脾淋巴细胞增殖试验结果表明,SAOG 各组OD450值均较模型组显著增高(P<0.05 或P<0.01),表明SAOG 能促进小鼠T 淋巴细胞的增殖,提示SAOG 可作用于免疫细胞而增强细胞免疫功能,但各剂量组在试验所用浓度值时相比无统计学差异、试验结果无规律改变。

细胞因子IL-2、IFN-γ 和TNF-α 在机体免疫细胞活化过程中起促进作用。本试验结果还表明,SAOG 能显著提高免疫低下小鼠外周血免疫细胞分泌的IL-2、IFN-γ 和TNF-α 等细胞因子,对免疫反应起正调节作用。根据试验结果,SAOG 可以正向调节CTX 致免疫低下小鼠的机体免疫功能,这一功能可能源自其对T 淋巴细胞的分化成熟的调节作用。该作用不仅能够提升小鼠细胞免疫的总体水平,还可促进免疫细胞分泌各种淋巴因子。

脾脏是人体最大的淋巴器官,本实验选取小鼠的脾脏作为研究对象,通过测定CTX 致免疫低下小鼠的脾淋巴细胞凋亡情况,间接的反映出SAOG 对免疫低下小鼠脾脏功能的影响。试验结果表明,与模型组相比,SAOG 三个不同剂量组均能抑制小鼠脾淋巴细胞凋亡,且高剂量组的效果最为明显。

病理学检查可以从不同水平上反映脏器、组织的健康状态。本试验组织病理学检查结果表明,给药SAOG 后不同剂量组脾、胸腺组织有不同程度的恢复,组织结构变清晰,淋巴细胞数量增多,以中/高剂量组效果好。据文献报道,中药多糖对受损伤的免疫器官有较好的保护和调节作用[10],而SAOG中五味子、黄芪、麦冬中含有大量多糖,可能是发挥调节作用的主要成分。同时人参皂苷可作用于机体的免疫器官、免疫细胞和免疫分子,提高机体非特异性免疫和特异性免疫功能[5]。

综上所述,吉医胶囊(SAOG)能显著增强小鼠免疫功能,很有开发前景,是有效的能增强免疫功能的组合方。