过表达MiR-381调控LRH-1-MMP-2通路抑制卵巢癌细胞转移的机制

李丹 李涛

(1崇州市人民医院肿瘤科，四川 崇州 611230；2四川省肿瘤医院)

近年来，卵巢癌在我国女性生殖系统肿瘤中的占比逐年升高〔1〕。卵巢癌早期无典型临床表现，大多数患者就诊时已处于疾病晚期，丧失了行根治性手术的机会〔2〕。对卵巢癌转移分子机制的研究有助于提高卵巢癌患者手术切除率并改善患者长期预后。MicroRNA(miR)是单长度较短的RNA，通常其碱基数量在18～25 bp之间〔3〕。卵巢癌细胞增殖〔4〕、转移〔5〕及血管生成〔6〕等恶性生物学过程中均证实有miR的参与。近年来研究表明，miR-381作为一种新的miR在胃癌〔7〕、结肠癌〔8〕及乳腺癌〔9〕中均表达降低，并能抑制肿瘤进展。目前，miR-381在卵巢癌中的表达水平及生物学功能尚不可知。本研究拟检测miR-381在卵巢细胞癌中的表达情况。

1 材料和方法

1.1组织标本 选取2014年1月至2015年10月于崇州市人民医院肿瘤科收治并行手术切除的45对卵巢癌及对应癌旁组织(距肿瘤边缘距离>2 cm)标本。

1.2细胞来源及主要试剂 SKVO3细胞由四川省肿瘤医院实验室保存；慢病毒(miR-381及阴性对照)、miR-381及U6引物分别由广州复能基因及广州锐博生物科技有限公司提供；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、Trizol试剂、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒、实时荧光定量试剂盒、 肝受体同源物(LRH)-1抗体(ab125034)、基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体(ab97779)、β-actin抗体(ab8226)、Transwell小室及硝酸纤维素膜分别购自美国Gibco、美国Invitrogen公司、美国abcam公司、美国康宁公司和美国Millipore公司。

1.3反转录实时荧光定量(qRT)-PCR RNA由Trizol试剂按说明书提取。按说明分别组建RT-PCR及实时PCR体系。RT-PCR条件：50℃反转录30 min，94℃变性2 min，共1循环。实时PCR条件：94℃变性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，共40循环；72℃最后延伸10 min。通过2-△△Ct法检测miR-381的相对含量。

1.4细胞培养及慢病毒感染 培养SKVO3细胞至稳定传代。按过夜增殖至融合度达70%，将SKVO3细胞接种于6孔板中。过夜培养后洗涤细胞。慢病毒感染分组：miR-381组每孔加入1 ml的miR-381慢病毒上清液、2 ml含血清DMEM及15 μg嘌呤霉素；miR-NC组即对照组每孔加入1 ml的阴性对照慢病毒上清液、2 ml含血清DMEM及15 μg嘌呤霉素。转染2 d后，使用特性抗生素溶液筛选稳定转染SKVO3细胞。

1.5划痕愈合试验 在6孔板中均匀接种稳定转染的SKVO3细胞。100 μl的枪头建立细胞划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗6孔板，每孔加入2 ml无血清DMEM。培养48 h后在显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。

1.6Transwell侵袭小室 用1×DMEM按8∶1稀释50 mg/L的基质胶，按100 μl每孔包被Transwell小室底膜上室面，4℃风干后放入24孔板内。收集转染稳定过表达miR-381的SKVO3细胞，以无血清DMEM培养基重悬后调整细胞密度为1×105/ml，按250 μl每孔接种于Transwell小室上室中，24孔板内每孔加入750 μl含10%FBS的DMEM培养基。培养箱内培养24 h后弃去上室内培养基，PBS洗涤2遍后采用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，棉棒擦去上室面残余细胞，在200倍显微镜下观察下室面细胞并计数。

1.7裸鼠肺转移瘤模型构建 随机选取BALB/c裸鼠6只，约5周龄大小，平均分为2组：miR-381组及miR-NC组。将稳定转染miR-381及miR-NC的SKVO3细胞制备成为2.0×105/ml密度的PBS细胞悬液。每只裸鼠经尾静脉注射0.1 ml细胞悬液，建立肿瘤血循环转移模型。裸鼠饲养4 w后处死，获取肺组织。甲醛溶液固定后制作苏木素-伊红(HE)染色切片。

1.8Western印迹法检测LRH-1蛋白、基质金属蛋白酶(MMP)2 检测细胞总蛋白采用放射免疫沉淀法(RIPA)提取，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，70 V湿转120 min转印目标蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封闭液室温封闭2 h后将目标条带分别置入相应一抗溶液中，4℃下孵育过夜。1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗在室温中孵育目标条带1 h。电化学发光法显影，自动曝光机固定条带影像，计算蛋白相对表达量。

1.9统计学分析 采用SPSS13.0软件进行χ2检验、成组t检验。

2 结 果

2.1miR-381在卵巢癌组织中低表达 通过RTPCR检测发现，45例卵巢癌组织中miR-381的表达水平(0.411±0.027)显著低于癌旁组织(1.208±0.031，t=5.221，P=0.017)。

2.2miR-381抑制SKVO3细胞增殖并促进其凋亡 感染miR-381慢病毒的细胞内miR-381表达水平(22.35±5.12)较miR-NC组(1.00±0.00)显著升高(t=17.341，P<0.001)。划痕愈合试验检测得知，过表达miR-381组剩余距离百分比为(76.28±10.89)%，miR-NC组为(48.39±8.23)%，过表达miR-38在体外显著降低了SKVO3细胞的迁移能力(t=4.113，P=0.025)；Transwell侵袭小室试验也表明，过表达miR-381组侵袭细胞数目〔(23.47±7.29)%〕显著低于miR-NC组侵袭细胞数目〔(78.28±8.41)%，t=3.682，P=0.031〕。见图1、图2。

2.3过表达miR-381抑制裸鼠肺转移瘤形成 过表达miR-381后SKVO3细胞在裸鼠肺脏中形成的肿瘤结节的面积〔(16.43±5.44)mm2〕显著低于miR-NC组〔(41.03±17.39)mm2，t=3.327，P=0.039〕。见图3。

图1 过表达miR-381抑制卵巢癌SKV03细胞迁移(×200)

图2 过表达miR-381抑制SKVO3细胞侵袭(结晶紫染色，×200)

图3 过表达miR-381表达对SKVO3细胞裸鼠肺转移结节形成的影响(HE，×100)

2.4过表达miR-381抑制SKVO3细胞中LRH-1及下游靶点MMP-2的表达 与miR-NC组相比，过表达miR-381的SKVO3细胞内LRH-1 mRNA及蛋白水平均显著降低(P<0.05、P<0.01)，LRH-1下游效应基因MMP-2蛋白的表达也明显下调(P<0.05)。提示miR-381可能是通过下调LRH-1/MMP-2的表达来发挥抗肿瘤效应。见图4、表1。

图4 过表达miR-381下调LRH-1、MMP-2蛋白表达

表1 过表达miR-381对SKVO3细胞内LRH-1及MMP-2表达的影响

3 讨 论

miR-381在不同类型的恶性肿瘤中的表达趋势并不一致。本研究说明miR-381在卵巢癌中可能是一种抑癌因子。通过实验证实，miR-381在体外培养细胞和机体内环境中均具有一定的抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用。除此之外，有研究指出，miR-381也能够抑制癌细胞活性和增殖能力，最终削弱癌细胞的生长〔10〕。

靶向结合目的基因mRNA的3'-非翻译区是miR发挥负向表达调控作用的经典机制。通过检索分析发现，LRH-1的mRNA存在miR-381的结合位点〔11〕。既往研究也表明LRH-1高表达是卵巢癌进展的促进因素〔12,13〕。本文显示过表达miR-381在体外的确能下调LRH-1的表达水平。在多种疾病模型中的研究结果表明LRH-1能够调节包括Wnt/β-catenin在内的多条信号通路而影响细胞的生物学特性〔14〕。研究表明，与肿瘤细胞侵袭转移相关的MMP-2也是LRH-1的下游效应分子之一〔15〕。在本研究提示miR-381抑制肿瘤转移的作用最终可能是通过下调MMP-2表达而实现的。

综上，miR-381在卵巢癌中低表达，上调miR-381可能通过抑制LRH-1、MMP-2的表达而抑制卵巢细胞癌转移。