流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序方法研究

王 娜，张 旻，张 舟，景宏丽，任 彤，张利峰，吴绍强

( 1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176； 2.北京海关技术中心，北京 101113 )

流行性造血器官坏死病是有鳍鱼类一种全身性的临床或亚临床的感染性疾病。世界动物卫生组织将流行性造血器官坏死病列入必须报告的疫病名录，我国将其列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》的二类传染病。流行性造血器官坏死病由流行性造血器官坏死病毒(Epizootichaematopoieticnecrosisvirus, EHNV)引起，流行性造血器官坏死病毒是一种双链DNA病毒，属于虹彩病毒科、蛙病毒属(Ranavirus)。红鳍鲈(Percafluviatilis)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)是仅有的天然感染的两种硬骨鱼类。虹鳟因流行率很低，虽然死亡率高，60%～80%的濒死鱼或死亡鱼中都可以分离出流行性造血器官坏死病毒，而未出现临床症状的鱼中，只有不到4%的鱼中可以分离到病毒，所以虽然死亡率很高，但仍然不易被怀疑或被检出[1-5]。各年龄阶段的虹鳟和红鳍鲈均易感，虹鳟的感染率低、死亡率高；而红鳍鲈的感染率和死亡率均非常高[3-4]。我国是鲈鱼和虹鳟养殖大国，如果发生流行性造血器官坏死病毒感染会给我国水产养殖业造成巨大经济损失，因此加强流行性造血器官坏死病的监测和流行病学调查是目前比较有效的预防措施；同时进行快速精确诊断方法的研究，是当前我国流行性造血器官坏死病防控的迫切需要。目前，流行性造血器官坏死病毒检测的标准方法主要是基于细胞培养的病毒分离，然后用组织病理、免疫荧光、ELISA、电镜技术和PCR等手段鉴定[5]，操作繁琐，诊断时间长，抗原捕获ELISA可以有效鉴定该病毒，但敏感性仅为60%，且难以区分流行性造血器官坏死病毒和蛙病毒属的其他成员[6]；PCR方法虽然灵敏，但仍会有假阳性出现的可能，需要通过测序进行确诊，延长了确诊时间；其他方法无法满足在分子水平上快速确诊病原的需求。

焦磷酸测序技术不需要荧光标记引物或核酸探针，不需要凝胶电泳，具有分析快速、准确、灵敏度高和实时检测的特点，适于对已知短序列的测序分析[7-9]，广泛应用于细菌、真菌和病毒的分型，突变位点的检测及单核苷酸多态性分析等[10-14]。该方法在普通PCR的基础上，对PCR产物进行测序，提高了检测的特异性，且给出了分子诊断的黄金标准—基因序列，减少了由于PCR敏感性高而出现的假阳性结果，提高了检测的准确性，目前该技术已经逐渐成为实验室非常重要的DNA分析新手段[15-16]。本研究针对流行性造血器官坏死病毒ORF65基因的保守区域，利用焦磷酸测序软件设计PCR扩增引物及焦磷酸测序引物，通过对反应条件与体系的优化，建立流行性造血器官坏死病毒ORF65基因的焦磷酸测序检测方法，为流行性造血器官坏死病的监测和防控提供新的检测手段。

1 材料与方法

1.1 病毒株

1.2 主要试剂及仪器

DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取试剂盒、PyroMark PCR Kit、PyroMark Gold Q96 SQA Reagents及焦磷酸测序仪PyroMark Q96 MD等均购自QIAGEN公司；链霉亲和素包被磁珠购自GE公司；500 bp DNA Marker等其他试剂购自TaKaRa公司。

1.3 引物设计

根据GenBank中公布的流行性造血器官坏死病毒 ORF65基因的特异区域序列，利用PSQ Assay Design SW软件设计PCR扩增引物EHNV-F：5′-Biotin-CTCAAGACCAAGAAGGCCATAA-3′和EHNV-R：5′-TTTTCGGACATGCTCTTCTTCA-3′及测序引物EHNV-S：5′-CTTCTCGATGCAAGAGT-3′，并在EHNV-F扩增引物5′端进行生物素标记，预期扩增片段长度为137 bp。引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 病毒DNA的提取

按照病毒DNA提取试剂盒说明书操作步骤提取核酸，立即用于PCR扩增或置-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 PCR反应

以病毒DNA为模板，用PyroMark PCR Kit进行PCR扩增并优化反应条件为：95 ℃预变性15 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45次循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将其送往公司进行测序。剩余的PCR产物用于焦磷酸测序反应。

1.6 单链制备及测序反应

根据焦磷酸测序反应操作说明制备单链模板。将20 μL的PCR产物与30 μL ddH2O混合后与200 μg链霉亲和素包被的磁珠混合，室温下1400 r/min振荡孵育15 min，用真空吸附泵吸附与磁珠结合的PCR产物，然后依次通过70%乙醇(5 s)、变性缓冲液(5 s)和冲洗缓冲液(5 s)清洗，最后移至PSQ96孔板上方释放磁珠，96孔板中预先加入45 μL/孔含有0.3 mol/L测序引物的结合缓冲液，将96孔板放入80 ℃烘箱中加热2 min后，冷却至室温。

根据仪器的软件说明在试剂舱中分别加入底物APS、dNTP和酶混合物(DNA聚合酶、荧光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)；然后将试剂舱和PSQ96板放入PyroMark Q96 MD测序仪中进行焦磷酸测序反应，在20～28 ℃下，所采用的碱基加入顺序为15(ATGC)，每轮测序检测运行时间为65 min，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号。

1.7 敏感性试验

将模板流行性造血器官坏死病毒DNA(5 ng/μL)依次进行10倍梯度稀释，PCR扩增后进行焦磷酸测序反应，确定用于焦磷酸测序的最低检测限。

1.8 特异性试验

1.9 重复性试验

重复进行3次试验，比较每次测得的序列结果，确定试验的重复性和稳定性。

1.10 样品检测

将实验室保存的流行性造血器官坏死病毒感染的虹鳟肝、脾、脑等10份组织、5份未感染流行性造血器官坏死病毒的虹鳟组织及50份监测样品，提取核酸进行焦磷酸测序检测，并与世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》中推荐的检测方法进行比较。

2 结 果

2.1 PCR反应

以流行性造血器官坏死病毒DNA为模板，使用本研究设计的流行性造血器官坏死病毒扩增引物及优化的反应条件进行PCR检测。结果显示，扩增出的特异性片段符合预期大小，没有非特异性扩增产物，满足进行焦磷酸测序反应的需要(图1)。公司测序结果表明，该目的条带与流行性造血器官坏死病毒ORF65基因片段同源性为100%。

2.2 焦磷酸测序反应

流行性造血器官坏死病毒ORF65基因的焦磷酸测序结果为CCATGAGGAA ATATCTTACC CTCTCAAACT GTCTGTCG。将该序列利用BLAST软件进行比较，与目的基因序列符合率为100%基因，即焦磷酸测序结果与普通测序结果完全一致，该序列能够作为流行性造血器官坏死病毒快速鉴定的靶序列(图2)。

图1 流行性造血器官坏死病毒 ORF65基因PCR扩增结果M.DL500 DNA Marker； 1.流行性造血器官坏死病毒 ORF65基因片段； 2.阴性对照.

图2 流行性造血器官坏死病毒 ORF65基因焦磷酸测序结果

2.3 敏感性试验结果

试验结果显示，流行性造血器官坏死病毒DNA模板10倍系列稀释至10-4时均扩增出与目的条带大小相符的特异性片段(图3)；经焦磷酸测序反应，模板稀释至10-4时，测定的序列均与流行性造血器官坏死病毒 ORF65基因的目标序列一致，为CCATGAGGAA ATATCTTACC CTCTCAAACT GTCTGTCG。结果表明，该试验方法最低核酸检测限为0.5 pg/μL(稀释度为10-4时)，以此为模板扩增得到的PCR产物可以用于焦磷酸测序。

2.4 特异性试验结果

图3 流行性造血器官坏死病毒敏感性试验结果M.DL500 DNA Marker； 1～7.流行性造血器官坏死病毒 5 ng/μL、0.5 ng/μL、0.05 ng/μL、5 pg /μL、0.5 pg /μL、0.05 pg/μL、5 fg/μL; 8.阴性对照.

2.5 重复性试验结果

重复进行3次试验，PCR扩增结果及测得序列一致，表明该方法具有很好的重复性与稳定性。

2.6 样品检测

利用本研究建立的焦磷酸测序检测方法对实验室保存的65份样品进行检测。10份阳性组织样品检测结果为阳性(包括1份弱阳性)、5份阴性组织样品检测结果为阴性，50份监测样品检测结果均为阴性，与世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》中推荐的PCR检测结果一致，符合率为100%。

3 讨 论

本试验通过优化反应条件，成功建立了流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测方法。该方法为国内外首次建立流行性造血器官坏死病焦磷酸检测技术。目前该技术已经逐渐成为实验室非常重要的DNA分析新手段[12-18]。国内研究人员针对施马伦贝格病毒[15]、传染性造血器官坏死病毒[16]、鲤春病毒血症病毒[17]、贝类包纳米虫[18]等病毒和寄生虫建立了焦磷酸测序检测方法。国外研究人员针对新城疫病毒、流感病毒H3N2等病毒也建立了针对不同毒株变异位点的焦磷酸测序方法并通过大量的临床样品检测验证了方法的有效性，有助于进行病毒学监测和流行病学调查[14,19]。

3.1 靶序列的筛选

3.2 焦磷酸测序引物的设计

焦磷酸测序技术要求选择的序列在100～200 bp，本研究选取编码流行性造血器官坏死病毒ORF65基因的核酸序列，利用软件进行序列分析后，设计了符合焦磷酸引物设计要求的扩增引物和测序引物，PCR扩增后将其产物进行焦磷酸测序反应，将获得的特异性序列作为流行性造血器官坏死病毒鉴定的靶序列。通常情况下，焦磷酸测序反应准确测出的碱基数为20～30 bp。本研究经优化测序反应后，准确测出的碱基序列达38 bp，完全满足证明待测样品是否为流行性造血器官坏死病毒ORF65基因序列的确诊要求，具有很好的特异性。与普通测序方法相比，检测效率提升，检测结果更加准确，适用于对流行性造血器官坏死病毒的大规模检测和流行病学调查。

3.3 与PCR检测方法的比较

根据世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》[5]中规定的PCR产物需通过测序才能最终确定病毒种类。本研究建立的流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序方法耗时短，一般3～4 h就可以得到基因序列，从而大大减少了病原确诊时间。利用该方法对实验室保存的65份样品进行检测，并与世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》中推荐的常规PCR方法进行对比，结果显示，焦磷酸测序方法与PCR方法检测结果一致。对于其中的弱阳性样品，常规PCR虽能检出但由于不能满足测序对样本含量的要求，因而不能进行有效测序，参照世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》的规定，由于不能进行有效测序，因而不能作为疫病阳性检出确诊的依据。而焦磷酸测序方法对于弱阳性样品样本可以直接给出基因序列，且检测结果与PCR完全一致，因而说明焦磷酸方法的高灵敏度是有效的，从而避免了假阳性检出。

本研究所建立的流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测方法具有准确性高、重复性和稳定性好，特异性强等优点，从基因序列水平上对流行性造血器官坏死病毒进行精准检测鉴定，为流行性造血器官坏死病毒的快速检测和流行性造血器官坏死病的确诊及流行病学调查提供了一种可行方法，对保障我国鲈鱼及虹鳟等鱼类养殖业的健康发展具有重要意义。