玉米赤霉烯酮对蛋鸡生产性能、血液指标和生殖激素水平的影响

2019-09-18凌阿茹郭晋丽郭文博杨俊花赵志辉

上海农业学报 2019年4期

凌阿茹，郭晋丽*，郭文博，杨俊花**，赵志辉

（1上海海洋大学食品学院，上海201306；2上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海201403）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是禾谷镰刀菌在适宜的温度和湿度条件下产生的一种真菌毒素，广泛存在于霉变的玉米、小麦和高粱等谷类作物中［1］。大量研究证实，ZEA及其代谢物能够引起畜禽真菌毒素中毒［2］，影响内脏器官发育［3］，还可导致动物繁殖障碍［4］、消化系统功能紊乱［5］，给养殖业造成极大危害。已有研究发现，ZEA与内源性雌激素在结构上相似，可通过与雌激素受体（Estrogen receptor，ER）的竞争性结合，发生一系列拟雌激素效应［6-7］，产生毒性。此外，ZEA与ER结合生成的化合物会转移至胞核内，调节基因转录和蛋白质合成，进一步影响细胞分裂和生长［8］。

蛋鸡作为养殖业的重要组成部分，每年因真菌毒素污染造成的经济损失不容忽视。目前，国内外关于ZEA单一毒素污染对蛋鸡毒性作用的研究报道非常少。Borutova等［9］通过给肉鸡饲喂3.44 mg/kg DON（Deoxynivalend）和3.36 mg/kg ZEA混合污染的饲料，发现混合毒素可以诱导肉鸡氧化应激进而影响免疫功能；伍宇超等［10］研究发现，低剂量的ZEA并不会影响育成期蛋鸡的生长性能，但会显著影响其血清生化指标和抗氧化指标。然而，目前关于ZEA对蛋鸡的生产性能、毒性作用、安全阈值等仍没有明确定论。

本试验选用ZEA标准品，采用直接灌胃的方式研究不同剂量ZEA处理对蛋鸡生产性能、蛋品质、血常规指标、血液生化指标和生殖激素水平的影响，观察ZEA对蛋鸡的临床毒性效应，探究蛋鸡对ZEA的安全剂量范围，旨在为真菌毒素毒理学研究提供有价值的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

ZEA标准品：浅褐色粉末，纯度≥99%，Pribolab，新加坡，（北京普华仁生物技术开发有限公司）；乙醇、乙腈：色谱纯，（Merck，美国）；氯化钠（上海埃彼化学试剂有限公司）；血清生殖激素ELISA试剂盒（上海润裕生物科技有限公司）。

标准品先用乙醇∶乙腈（4∶1，v∶v）溶解，后用生理盐水稀释，其中乙醇∶乙腈的终体积浓度控制在1%以下。

EMT-7300型多功能蛋品分析仪（Robotmation，日本）；EFG-0503型蛋壳强度测定仪（Robotmation，日本）；Sorvall ST-16R型高速冷冻离心机（Thermo Fisher，美国）；HB型全自动血细胞分析仪（英诺华，中国）；Au-5800型全自动血液生化分析仪（Beckman，美国）；Infinite M-200型多功能酶标仪（Tecan，瑞士）。

1.2 饲养管理与试验设计

随机选取同一批次、同一品种、体况良好、产蛋率一致的34周龄海兰蛋鸡100只，随机分为5组，每组设4个重复，每个重复5只，于2017年10月10日至11月21日在上海市农业科学院畜牧兽医研究所动物房进行饲养。采用直接灌胃的方式，对照组灌胃等量生理盐水，试验组分别灌胃0.5 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg ZEA（饲粮，每只鸡按每天150 mg饲粮饲喂），预饲期2周，试验期4周，试验期间连续灌服ZEA，每天下午产蛋结束后进行。选用3层阶梯笼养，每笼1只，按照封闭式蛋鸡养殖场规定饲养，保证每天充足光照16 h，室温范围16—20℃，湿度50%—60%。每日6：00喂料1次，自由采食、饮水。蛋鸡饲喂基础饲粮（表1）参照鸡的饲养标准（NY/T 33—2004）并结合罗爱琼等［11］的方法配制。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient levels in basal diet（air dry basis） %

1.3 样品采集与检测

1.3.1 生产性能

每天详细记录各组的产蛋数、软破壳蛋数、蛋重、采食量和死亡鸡只数，每周测鸡体重，计算整个试验期不同组的平均蛋重、产蛋率、采食量、料蛋比。计算公式如下：

平均蛋重（g）=平均每日总蛋重/总蛋数；

产蛋率=平均每日总蛋数/鸡数×100%；

采食量（g/d）=每日消耗饲粮总量/鸡数；

料蛋比=采食量/产蛋重。

1.3.2 蛋品质测定

试验结束前3 d（2017年11月19—21日），连续收集各试验组鸡蛋，每组随机选取30枚鸡蛋用多功能蛋品分析仪和蛋壳强度测定仪检测以下指标：蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋白高度、哈氏单位、蛋黄颜色、蛋壳颜色等。

1.3.3 血常规指标测定

试验结束时（2017年11月21日），每只鸡用真空管翅静脉采血5 mL。其中，1 mL由加肝素钠抗凝剂的真空管收集，30 min内用全自动血细胞分析仪测定血常规指标：白细胞总数（WBC）、淋巴细胞总数（LY）、单核细胞数（MO）、中性粒细胞数（GR）、血红蛋白浓度（HGB）、红细胞压积（HCT）、红细胞总数（RBC）、红细胞平均体积（MCV）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、血小板总数（PLT）；4 mL由不含抗凝剂的真空管收集，3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，-20℃冷冻保存，用于血液生化指标分析及激素水平测定。

1.3.4 脏器系数

采血结束后，每个试验组每个重复随机选取3只鸡，共60只进行宰杀，手术分离心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和子宫等器官，准确称重并根据如下公式计算：

脏器系数=脏器重量（g）/动物体重（g）×100%。

1.3.5 血液生化指标测定

用全自动血液生化分析仪对以下指标进行测定：白蛋白（ALB）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素（UREA）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBILI）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总蛋白（TP）、肌酐（CRE）、球蛋白（GLB）。

1.3.6 血清生殖激素水平分析

多功能酶标仪对血清中以下激素水平进行测定：促黄体素（Luteinizing hormone，LH）、卵黄蛋白原（Vitellogenin，VTG）、孕酮（Progesterone，P4）、β内啡肽（β-endorphin，β-EP）、雌二醇（Estradiol，E2）、生长激素（Growth hormone，GH）和促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，FSH）。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。差异显著性检验采用单因素方差分析（One-way ANOVA，LSD），其中P＜0.05为差异显著、P＜0.01为差异极显著，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 ZEA对蛋鸡生产性能的影响

由表2可见，各试验组蛋鸡体重均未见显著变化。与对照组相比，只有5 mg/kg组产蛋率显著提高，且显著高于其他各组（P＜0.01）；同时50 mg/kg组的产蛋率还显著低于0.5 mg/kg组（P＜0.05）。此外，5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg组的采食量均显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），200 mg/kg组还显著高于0.5 mg/kg组（P＜0.05）。与对照组相比，0.5 mg/kg、5 mg/kg和50 mg/kg组平均蛋重显著提高（P＜0.05或P＜0.01），200 mg/kg组却显著降低（P＜0.01）；与0.5 mg/kg组相比，5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg组平均蛋重均极显著降低，且呈剂量效应关系（P＜0.01）。与对照组相比，0.5 mg/kg组料蛋比无显著变化（P＞0.05），5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg组均显著提高（P＜0.05或P＜0.01），其中200 mg/kg组料蛋比显著高于5 mg/kg和50 mg/kg组（P＜0.05）。

表2 不同剂量ZEA对蛋鸡生产性能的影响Table 2 Effects of ZEA with different doses on laying performance in laying hens

2.2 ZEA对蛋品质的影响

由表3可见，各试验组蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋白高度、哈氏单位均未见显著变化。与对照组相比，0.5 mg/kg、5 mg/kg和50 mg/kg组蛋形指数均无显著变化，只有200 mg/kg组显著提高（P＜0.05）；0.5 mg/kg和50 mg/kg组蛋黄颜色显著降低，而5 mg/kg和200 mg/kg组无显著变化。0.5 mg/kg组蛋壳颜色较对照组显著降低（P＜0.05），其余各组均无显著变化，而与0.5mg/kg组相比，50mg/kg组蛋壳颜色显著提高（P＜0.05）。

表3 不同剂量ZEA对蛋品质的影响Table 3 Effects of ZEA with different doses on egg quality

2.3 ZEA对蛋鸡各组织脏器系数的影响

由表4可见，各试验组心、肝、脾、肺和子宫的脏器系数均无显著差异。与对照组相比，50 mg/kg和200 mg/kg组肾脏系数显著提高（P＜0.05）。随着ZEA灌胃剂量的增加，卵巢系数有降低趋势，但在统计学上无显著差异，只有200 mg/kg组显著低于对照组（P＜0.05）。

表4 不同剂量ZEA对蛋鸡各组织脏器系数的影响Table4 Effects of ZEA with different doses on organ indexes in laying hens %

2.4 ZEA对蛋鸡血常规指标的影响

由表5可见，各试验组HGB、HCT、RBC、MCV、MCHC和PLT均未见显著变化。与对照组相比，0.5 mg/kg组WBC和LY数量均无显著变化，5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg组的WBC和LY数量均显著增加（P＜0.01），且呈剂量-效应关系；同时，50 mg/kg和200 mg/kg组WBC和LY数量显著高于5 mg/kg组（P＜0.01）。随着ZEA灌胃剂量的增加，MO和GR数量逐渐增加，也呈剂量-效应关系，其中50 mg/kg和200 mg/kg组均显著高于对照组（P＜0.01）。

表5 不同剂量ZEA对蛋鸡血常规的影响Table 5 Effects of ZEA w ith different doses on hematological indices in laying hens

2.5 ZEA对蛋鸡血液生化指标的影响

由表6可见，各试验组除了UREA和CRE外，其他生化指标均未呈现显著差异。与对照组相比，0.5 mg/kg组UREA浓度无显著变化，5 mg/kg和50 mg/kg组显著升高（P＜0.05），200 mg/kg组极显著升高（P＜0.01）。随着ZEA灌胃剂量的增加，CRE浓度有上升的趋势，与对照组相比，只有50 mg/kg和200 mg/kg组CRE浓度显著升高（P＜0.05）。

表6 不同剂量ZEA对蛋鸡血液生化指标的影响Table 6 Effects of ZEA w ith different doses on serum biochem ical parameter in laying hens

2.6 ZEA对蛋鸡血液生殖激素水平的影响

由表7可见，各试验组血清中VTG、E2、GH和FSH水平均无显著差异。与对照组相比，0.5 mg/kg组LH和P4水平均无显著变化，5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg组LH水平均显著降低（P＜0.01），P4水平均显著提高（P＜0.05），呈现剂量-效应关系。此外，0.5 mg/kg和5 mg/kg组β-EP水平无显著变化（P＞0.05），50 mg/kg和200 mg/kg组较对照组显著提高（P＜0.05或P＜0.01），且200 mg/kg组显著高于50 mg/kg组（P＜0.01）。

表7 不同剂量ZEA对蛋鸡血液生殖激素水平的影响Table 7 Effects of ZEA w ith different doses on reproductive hormone levels in laying hens

3 讨论

3.1 ZEA对蛋鸡生产性能的影响

Jia等［12］研究发现，ZEA污染量为0.2602 mg/kg的日粮对蛋鸡产蛋量和采食量均无显著影响。本试验中，当ZEA剂量不高于0.5 mg/kg时，与对照组相比产蛋率和采食量均无显著变化，与Jia等［12］研究结果一致。当ZEA剂量达到5 mg/kg时，产蛋率、采食量和料蛋比较对照组均显著提高，表明低剂量的ZEA能够提高蛋鸡产蛋性能。有研究显示，禽类的产蛋性能与卵巢卵泡的生长发育密切相关［13］，笔者推测ZEA作为一种类雌激素，当剂量为5 mg/kg时可促进蛋鸡性腺和卵泡发育，进而提高蛋鸡的产蛋率，但其作用机制仍需进一步深入探究。本研究中，0.5 mg/kg的ZEA可以使蛋重显著提高，当ZEA剂量达到200 mg/kg时，蛋重显著降低，表明高剂量的ZEA会产生过雌激素毒性作用，对卵巢造成损伤，降低蛋鸡产蛋性能，有研究发现，ZEA会抑制肉鸡、猪、狗和大鼠等雌性动物的卵巢发育［14-17］。

3.2 ZEA对蛋品质的影响

蛋品质作为评价鸡种优劣的重要指标，本试验中，对照组蛋形指数在正常值范围内，200 mg/kg组较对照组显著提高，这可能与高剂量的ZEA影响蛋鸡生殖功能和器官发育有关。ZEA与雌激素受体结合表现出弱雌激素活性，会造成动物体内生殖激素紊乱，生殖器官损伤，对动物繁殖机能造成严重的影响［15］。有研究显示，蛋壳颜色不仅与遗传有关，还与壳上膜的量及其中所含色素的量有关，壳上膜是蛋壳的最外层，母鸡壳上膜的分泌量不随年龄的变化而提高，但在蛋重增大时，有限的壳上膜分布不到扩大的蛋壳上，因此蛋壳颜色变浅［18］。在本研究中，与对照组相比，只有0.5 mg/kg组蛋壳颜色显著降低，因此推测与其蛋重显著提高有关。另外，与对照组相比，0.5 mg/kg和50 mg/kg组蛋黄颜色显著降低，这可能与ZEA影响卵泡发育，导致色素沉积不充分有关。因为色素沉积会随卵巢中卵泡的发育而增强，而卵泡发育通常需要5—10 d，因此蛋黄完全着色需要5—10 d［13］，推测在此过程中ZEA破坏蛋鸡的生殖发育系统，影响了卵泡发育，进而影响色素沉积最终导致蛋黄颜色变浅，但其作用机制有待进一步深入研究。

3.3 ZEA对蛋鸡各组织脏器系数的影响

脏器系数能够直观地反映不同浓度外源性有毒有害物质作用后的蛋鸡内脏器官生长发育或病变情况。脏器系数增大，提示脏器充血、水肿或增生肥大等变化；脏器系数减小，提示脏器萎缩及其他退行性疾病。Salem等［19］研究发现，40mg/kg b.w.的ZEA可使小鼠肾脏细胞发生氧化应激反应，诱导细胞死亡，从而对肾脏产生毒性作用。本研究中，随着ZEA灌胃剂量的增加，各试验组的肾脏脏器系数逐渐增加，呈剂量-效应关系，当ZEA灌胃剂量高于50 mg/kg，肾脏脏器系数较对照组均显著提高，表明ZEA灌胃剂量高于50 mg/kg时，会诱导肾脏水肿充血，增生肥大，对肾脏造成明显损伤。Jia等［20］研究发现，给妊娠母猪饲喂被ZEA污染的饲粮后，肾脏发生肿大，与本试验结果一致。当ZEA灌胃剂量达到200 mg/kg时，卵巢脏器系数显著降低，表明200 mg/kg的ZEA会使蛋鸡卵巢萎缩，造成损伤，进一步证明了高剂量ZEA对蛋鸡卵巢的损伤作用。Zwierzchowski等［21］也发现，0.2 mg/kg.b.w.的ZEA处理母猪后，会抑制其卵巢卵泡的生长发育，提示与ZEA诱导卵巢颗粒细胞发生凋亡有关。这些毒性作用，一方面与ZEA发挥类雌激素作用，与细胞质雌激素受体结合、进入细胞核导致染色体异常，抑制DNA和蛋白质合成有关，另一方面与ZEA诱导细胞氧化损伤进而发生凋亡相关［22］。

3.4 ZEA对蛋鸡血常规指标的影响

伍宇超等［10］通过在育成期蛋鸡基础日粮中添加0.4 mg/kg的ZEA发现，蛋鸡血液中性粒细胞数显著提高；Maaroufi等［23］发现，给雌性大鼠腹膜注射1.5—5.0 mg/kg的ZEA，48 h后大鼠血液白细胞数量显著提高。本研究也发现当ZEA灌胃剂量高于5 mg/kg时，蛋鸡血液中WBC、LY和GR数量均显著提高；当剂量高于50 mg/kg时，MO数量显著提高，可见当ZEA高于5 mg/kg时可诱导蛋鸡发生严重的炎症反应。

3.5 ZEA对蛋鸡血液生化指标的影响

尿素（UREA）和肌酐（CRE）水平是体现肾脏肾小球的滤过功能的重要指标，当肾脏受损时会引起UREA和CRE浓度升高。本试验中，当ZEA灌胃剂量高于50mg/kg时，血清中UREA和CRE浓度较对照组均显著提高，表明ZEA浓度在高于50 mg/kg时会严重损伤蛋鸡肾脏。孙真真等［24］给蛋鸡灌胃ZEA后也发现血清中UREA和CRE浓度显著提高，与本研究结果一致，进一步证明肾脏是ZEA毒性作用的另一靶标器官。

3.6 ZEA对蛋鸡血清生殖激素水平的影响

研究显示，创伤后血浆内β-EP水平升高，推测β-EP水平也是反应创伤早期炎症变化的重要标志物之一［25］。本试验中，当ZEA灌胃剂量高于5 mg/kg时，与对照组相比β-EP水平显著提高，进一步表明ZEA诱导机体发生了严重的炎症反应。促黄体素（LH）能诱导排卵前的卵泡生长发育并触发排卵，促进黄体形成同时分泌孕酮（P4）。在本研究中随着ZEA灌胃剂量的增加，LH水平逐渐降低，且呈剂量-效应关系。当ZEA剂量高于5mg/kg时，与对照组相比各试验组LH水平均极显著降低，这可能与ZEA的类雌激素作用有关，由于雌激素对下丘脑和垂体发挥负反馈调节作用，当ZEA进入蛋鸡体内后代替雌激素发挥作用，诱导垂体促性腺激素分泌水平降低，进一步导致LH水平降低。而P4水平的极显著提高，进一步证明了ZEA是通过持续发挥类雌激素作用来诱导P4分泌水平提高的。