基于16S和COⅠ基因探讨岩扇贝在扇贝科中的分类地位

曹善茂 朱丽洁 聂鸿涛

摘要：采用PCR扩增和序列测定等技术，对岩扇贝（Crassadoma gigantea）线粒体DNA 16S rRNA和CO Ⅰ基因片段进行初步研究，得到16S rRNA基因片段的大小在613.0～634.0 bp之间，A、T（U）、G、C的平均含量分別为26.5%、29.7%、24.5%、19.3%;CO Ⅰ基因片段的大小为660 bp，碱基A、T、G、C的平均含量分别为17.2%、40.3%、27.2%、15.3%。16S基因在岩扇贝中偏好使用GUU、UUG、AUU、ACG、UAU、CAA、GAG、UUU、UCU、GAU、GGU、GAG、AGG和GGA等25个密码子。COⅠ系统进化树表明，与岩扇贝亲缘关系最近的是柿孔扇贝（Azumapecten farreri），其次是冰岛扇贝（Chlamys islandica）。16S系统进化树亲缘关系由近到远依次是北美扇贝（Patinopecten caurinus）、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）、Chlamys islandica。

关键词：岩扇贝;CO Ⅰ基因;16S rRNA;密码子偏好性;系统进化树分析

中图分类号： S917.4  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0028-04

岩扇贝（Crassadoma gigantea）隶属于软体动物门、瓣鳃纲、珍珠贝目、扇贝科。原产于北美洲太平洋沿岸海域，广泛分布于美国的阿拉斯加，加利福尼亚半岛以及墨西哥湾附近。该贝具有闭壳肌大、肉质鲜美、风味独特、生长速度快、对环境适应能力强等优点，2013年大连海洋大学科研人员从加拿大温哥华岛引进岩扇贝成贝，在辽宁省沿海各地进行人工育苗和人工养殖，并对其进行了人工育苗技术和幼贝摄食生理等研究[1-3]。国外学者对岩扇贝的营养成分、口味、冷藏肉质的稳定性、野生种群的生长速率、排精产卵机制、幼贝的饵料配比、附着生理、胚胎发育等方面进行了研究[4-9]。日常岩扇贝通过岩扇贝壳型、颜色等形态特征进行分类，比较而言应用分子生物学的分析方法对岩扇贝的分类及鉴定较少。Bernard建立了包含必须以固着而生的岩扇贝的岩扇贝属（Crassadoma）[10]。Waller扩展了岩扇贝属的范围，包含其他固着和非固着的Hinnites种，并创造了包括Caribachlamys属在内的Crassadomini[11]。可见岩扇贝在扇贝科下的亲缘关系并不明确，Saavedra等研究了岩扇贝与太平洋部分扇贝和加勒比海扇贝的进化关系[12]。本研究在其基础上增加国内经济贝类，如栉孔扇贝、虾夷扇贝等，应用DNA条形码技术进行进一步的研究。DNA条形码是利用足够变异的标准化短基因片段构建物种的鉴别体系，具有对物种进行快速、准确鉴定的新生物身份识别的优势[13-15]。本研究采用PCR扩增和序列测定技术，对岩扇贝线粒体DNA 16S rRNA和CO Ⅰ基因片段进行初步研究，进一步证实岩扇贝在扇贝科中的分类地位及亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

岩扇贝于2016年11月取自辽宁省旅顺河口养殖基地，鉴定后活体解剖取扇贝闭壳肌于液氮冷冻后转-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取和检测 随机选取岩扇贝2个，取大约30 mg闭壳肌组织，尽量剪碎，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并溶解于100 μL Tris-EDTA缓冲buffer（TE溶液）中，用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，然后将基因组DNA稀释至50 ng/μL，4 ℃ 下保存备用。

1.2.2 PCR扩增及测序 本试验使用CO Ⅰ和16S引物序列进行PCR扩增（表1），所有PCR反应均采用预混合酶试剂（premix），配制 10 μL 体系，在PTC-100型PCR仪上进行反应。PCR反应程序为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，16S变性1 min，CO Ⅰ和16S分别48 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共运行35个循环;最后1个循环结束后72 ℃再延伸 5 min。PCR产物用含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察、照相。用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司生产]纯化后，进行双向测序。

1.2.4 数据处理 本试验选取2个岩扇贝个体进行测序，所获原始序列首先与其对应峰图对比检查，以确认序列质量;每个个体测得正反向序列并用BioEdit软件进行拼接，结合人工校正;在NCBI数据库中进行Blast比对分析，确定序列准确性。下载扇贝科下物种序列[16]，应用MEGA 7软件检查平均一致度估测联配结果的可信度;计算16S的种内遗传距离;基于CO Ⅰ和16S rDNA，应用邻接树（neighbor joining，简称NJ）法分别重建系统发生树;运用MEGA 7软件Codonusage功能计算同义密码子出现的次数及使用度[17]，16S基因密码子偏好性分析，同义密码子使用度（RSCU）计算公式为

RSCUij=xijx=xij1ni∑nij=1xij。

式中：xij表示编码第i个氨基酸的第j个密码子的出现次数;ni表示编码第i个氨基酸的同义密码子数量（其值为1～6）。当密码子的RSCU值等于1时，表示该密码子没有偏好性;当密码子的RSCU值小于1时，表示该密码子使用较少;当密码子的RSCU值大于1时，表示该密码子使用较多[18]。

2 结果与分析

2.1 岩扇贝CO Ⅰ和16S的DNA序列组成

本研究对岩扇贝的CO Ⅰ和16S基因进行PCR扩增，得到清晰的基因片段扩增产物，纯化后直接进行双向序列测定，经过比对和校正后提交GenBank数据库。测序结果表明，CO Ⅰ 基因片断大小为660 bp，序列的A、T、G、C平均含量分别为17.2%、40.3%、27.2%、15.3%，其中A+T的含量（57%）明显高于 G+C的含量（42%）;16S基因片段大小为613.0～634.0 bp（不包含引物），序列A、T（U）、G、C平均含量分别为26.5%、297%、24.5%、19.3%（表2），其中A+T（U）的含量（56.2%）高于G+C的含量（43.8%）。CO Ⅰ和16S碱基均出现偏倚性，符合线粒体碱基组成的特点。将研究中测定及下载的所有16S序列进行整理，并裁剪为同一长度529 bp进行分析，其保守位点153个，变异位点369个，简约信息位点315个，单独位点54个。

2.2 系统发育树的物种鉴定

本试验选取珍珠贝科马氏珠母贝、牡蛎科长牡蛎、莺蛤科白斑珍珠蛤作为外群，在CO Ⅰ和16S进化树中C. gigantea单独聚为1支，马氏珠母贝（Pinctada martensi），白斑珍珠蛤（Pinctada maculata）聚為1支。CO Ⅰ进化树的p-distance<08，16S序列的Jukes-Cantor分析值为0.246，这2个值分别说明CO Ⅰ和16S所选序列适合构建NJ树。CO Ⅰ的NJ树表明，C. gigantea进化依次接近于栉孔扇贝（Azumapecten farreri），冰岛扇贝（Chlamys islandica），北美扇贝（Patinopecten caurinus），虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis），其中后三者聚为1支（图1）。16S的NJ树表明，岩扇贝5个序列形成具有较高支持度的单分支且依次接近于北美扇贝（Patinopecten caurinus）、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）、Chlamys islandica（图2）。扇贝科的5个属，其中类栉孔扇贝属的华贵栉孔扇贝（Mimachlamys nobilis）单独聚为1支;海湾扇贝属的海湾扇贝（Argopecten irradians）、紫扇贝（A. purpuratus）、A. ventricosus聚为1支;栉孔扇贝属的C. farreri、A. farreri和S. livida为1支;掌扇贝属的平濑掌扇贝（Volachlamys hirasei）、新加坡掌扇贝（V. singaporina）聚为1支;盘扇贝属的M. yessoensis、P. caurinus聚为1支，聚类结果基本与传统的分类结果一致。

2.3 岩扇贝中16S基因的密码子偏好性

16S在岩扇贝中扩增偏向使用以U或G结尾的密码子，总使用度分别为12.76、8.02。其中GUU、UUG、AUU、ACG、UAU、CAA、GAG、UUU、UCU、GAU、GGU、GAG、AGG和GGA等25个密码子的RSCU值均大于1，其中GUU的RSCU值大于2，为16S在岩扇贝中偏好性使用次数最多的（表3）。

3 讨论

孔晓瑜等做了栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体16S rRNA基因片段的比较研究，A+T的含量分别为54.73%、55.17%[18]。胡丽萍等在紫扇贝和海湾扇贝中扩增16S，获得基因片段长度均为542 bp，紫扇贝和海湾扇贝的碱基组成 A+T所占比例分别为54.2%、55.1%[19]。朱立静等对四角蛤蜊CO Ⅰ基因的研究表明，四角蛤蜊的G+C含量明显低于A+T含量[20];程汉良等对帘蛤目中6种贝类进行CO Ⅰ序列的扩增结果也表明，A+T含量明显高于G+C含量[21]。这与本研究中CO Ⅰ在岩扇贝中的扩增结果相似。一般认为，

在线粒体基因组中，16S rRNA基因进化速率低，比较保守，而CO Ⅰ基因为变异性较大的区域，在不少无脊椎动物中检测到了较大的变异[22-23]。从本试验结果可以看出，在剪裁为 529 bp 的16S rRNA片段中，其保守位点153个，变异位点369个，变异位点比例达到69.8%，即岩扇贝种内变异率较高，原因可能是16S存在较高的碱基转换和颠换，这部分有待后续进行进一步讨论。

Thompson等认为成对联配的氨基酸序列的平均一致性百分比太低时，多序列联配的结果准确性会下降，一致性百分比等于1减去p-distance[24]。 当p-distance﹤0.8，联配结果是可接受的;当p-distance≥0.8则是不可靠的。本试验CO Ⅰ的p-distance为0.746，对应的一致性为25.4%，介于20%和30%之间的临界区域，氨基酸残基的联配正确率在80%左右，另一项研究表明，氨基酸联配的精确性大于50%时，它对系统进化树准确性的影响就微乎其微了，即该COⅠ系统进化树是可信且可用的[25]。同理，16S序列的Jukes-Cantor分析值为0.246，说明16S的NJ树可信且可用。

Saavedr等分析表明，C. gigantea进化上接近C. islandica，其次是岩扇贝属的其他成员如Crassadoma multistriata、Mimachlamys varia[12]。在本试验16S的NJ树中，C. gigantea更接近P. caurinus和M. yessoensis，其次是C. islandica，在CO Ⅰ的NJ树中更接近于A. farreri，2个NJ树不一致的原因可能是2个基因片段剪裁序列的长度不同导致联配一致度不同。Feng 等研究表明，在CO Ⅰ进化树中芬香海扇蛤（D. plica）、大海扇蛤（P. maximus）、A. pleuronectes、A.irradians聚为1支，在16S进化树中Pecten maximus、Amusium pleuronectes、Argopecten irradians和其他扇贝聚为1支而Decatopecten plica单独聚为1支[16]。

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