包被复合微量元素与常规微量元素对生长中期草鱼生产性能、消化吸收能力和肠道生长发育的比较研究

2019-09-17周小秋

四川农业大学学报 2019年4期

胡凯，陈康，周小秋*

（1.四川农业大学动物营养研究所，成都 611130；2.成都农业科技职业学院畜牧兽医分院，成都 611130）

饲料中添加微量元素是防止养殖动物微量元素缺乏的主要途径。长期以来，主要以无机微量元素的形式添加。然而，无机微量元素由于生物学有效性低，致使在动物生产中超量添加，给动物带来应激、健康问题及环境污染[1-2]。因此，提高动物对微量元素利用率是目前矿物元素营养的研究热点之一。包被复合微量元素通过物理隔离，减少了微量元素间及饲料中维生素等营养物质的氧化作用，同时降低了无机金属离子对动物消化道黏膜的刺激损伤，提高了其利用率。零星研究表明，饲料中添加包被复合微量元素提高了育肥猪平均日采食量[3]，黄羽肉鸡、育肥猪平均日增重[3-4]，显著降低黄羽肉鸡和育肥猪料重比[3，5]。然而，关于饲料中添加包被复合微量元素对鱼类生产性能、消化吸收能力和肠道生长发育的影响及其与常规微量元素作用效果的系统比较研究未见报道。因此，本试验通过比较研究包被复合微量元素与常规微量元素对生长中期草鱼生产性能、消化吸收能力、肠道生长发育和肠道微的影响，探讨包被复合微量元素在淡水鱼饲料中的添加效应及应用，为包被复合微量元素在淡水鱼养殖上的应用提供部分参考。

1 材料和方法

1.1 试验设计与试验饲料

试验所用包被复合微量元素由福建深纳生物工程有限公司提供，其微量元素种类及含量见表1。以鱼粉、豆粕、棉籽粕和菜粕为主要蛋白源配置基础饲料，组成及营养水平见表2。试验设计参考宋琼莉等[6]方法进行，即试验Ⅰ～Ⅴ组为包被符合微量元素添加组，分别向基础饲料中添加0、150、300、400和450 mg/kg 包被复合微量元素；Ⅵ组为常规微量元素组[对照组，NRC（2011）]，向基础饲料中添加常规微量元素预混料。各处理组中微量元素添加水平见表3；其他营养水平各处理组保持一致。

表1 包被复合微量元素中微量元素组成及含量Table 1 Trace element composition of coated slow-release multi-trace elements g·kg-1

表2 基础日粮配方及主要营养指标Table 2 Composition and nutrients content of the basal diets %

表3 各处理组试验饲料中微量元素添加水平Table 3 The levels of trace elements in treatment feed mg·kg-1

1.2 饲养管理

试验在四川农业大学动物营养研究所水生动物营养研究基地进行。草鱼购回经4 周驯养后，选择初始体重为（266.0±60.60）g 的健康中期草鱼540尾，随机分到 18 个网箱（1.4 m×1.4 m×1.4 m），每个网箱30 尾（随机分为6 组，每组3 个重复）。分别饲喂对照和试验饲料，试验期8 周。饲养管理参照本实验室前期研究建立的管理模式进行[8]，即每天定点投喂4 次，每次投喂30 min 后收集残饵并烘干后称重；试验期间，水温和pH 分别维持在（28±2）℃和 7.2±0.2，养殖水体中溶氧＞6 mg/L。

1.3 样品采集与指标测定

生长试验开始和结束时分别以网箱为单位称量试验鱼体重，用以计算体增重（weight gain，WG）和特定生长率（specific growth rate，SGR）。每日记录投饵量，收集残饵并称重用于采食量（feed intake，FI）和饵料系数（feed coefficient，FC）的计算。正式试验期间记录各组试验鱼死亡数用于成活率（survival rate，SR）计算。饲养试验结束后，参照本实验室前期建立的样品采集方法进行样品采集[9]。每组随机选择12 尾生长中期草鱼，进行称重、体长测量、采血，随后迅速分离肠道并称重，测量肠长，分离前、中、后肠，再用液氮迅速冷冻后置于超低温冰箱（-80 ℃）中保存待测。此外，每组随机另选5 尾试验鱼，参照Lin Y.等[10]描述的方法测量肠道皱襞高度。全肠蛋白含量，全肠胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活力，前肠胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）含量，前、中、后肠碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、Na+，K+-ATP 酶（Na+，K+-ATPase）、γ-谷氨酰转肽酶（γglutamyl transpeptidase，γ-GT）活力的测定均参照Zeng Y.Y.等[9]描述的方法进行。肠道微生物测定参照Feng L.等[11]描述的方法进行。

1.4 计算公式

SR、WG、FI、FC、SGR、肠体指数（intestosomatic index，ISI）和肠长指数（relative gut length，RGL）的计算。

SR（%）= [初始鱼总数（尾）-死亡鱼数（尾）]/初始鱼总数（尾）×100

WG（g/尾）=试验鱼末重（g/尾）-试验鱼初始重（g/尾）

FI（g/尾）=总投饵量（g/尾）-总残饵量（g/尾）

FC=采食量（g/尾）/增重（g/尾）

SGR={[ln 终末体重（g）-ln 初始体重（g）]/试验天数（d）}×100

ISI=肠重（g/尾）/体重（g/尾）×100

RGL=肠长（cm）/体长（cm）×100

1.5 数据处理与统计分析

试验数据用平均数±标准差表示，采用SPSS18.0 对试验数据进行统计分析。对不同添加水平的包被复合微量元素组试验数据进行单因素方差分析，并结合Duncan 氏法进行多重比较，以P＜0.05 作为差异显著水平。对统计学差异显著的包被复合微量元素组试验数据进行回归分析。将包被复合物微量元素组（生产性能最佳）与常规微量元素组 [对照组，NRC（2011）]试验数据进行 t 检验，以检验不同处理之间的差异显著性，显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 包被复合微量元素和常规微量元素对生长中期草鱼生产性能的影响

所有处理组生长中期草鱼SR 均为100%。包被复合微量元素对生长中期草鱼生产性能有显著影响（表4，P＜0.05）。生长中期草鱼终末体重（Final boday weight，FBW）、WG、FI、SGR 先随饲料中包被复合微量元素添加水平的增加而显著提高（P＜0.05），当饲料中包被复合微量元素添加水平为300 mg/kg 时均达到最大值，而后均随着饲料中包被复合微量元素添加水平的进一步添加而显著降低（P＜0.05）。包被复合微量元素对生长中期草鱼FC 的影响与FI的趋势相反，当其添加水平为300 mg/kg 时达到最小值。回归分析表明：饲料中包被复合微量元素添加水平（x）分别与生长中期草鱼的 WG（yWG）、SGR（ySGR）、FI（yFI）和FC（yFC）呈极显著二次曲线关系，回归方程分别为 yWG=-2.717E-3x2+1.298x+286.296（R2=0.924，P＜0.01）、ySGR=-7.712E-6x2+0.004x+1.309（R2=0.934，P＜0.01）、yFI=-3.058E-3x2+1.475x+583.621（R2=0.960，P＜0.01）、yFC=5.488-6x2-0.003x+2.026（R2=0.823，P＜0.01）。与常规微量元素组（对照组）相比，包被复合微量元素组（生产性能最佳，300 mg/kg）生长中期草鱼的FBW、WG、FI 和SGR 显著高于常规微量元素组（P＜0.05），而 FC 显著降低（P＜0.05）。分别以 SGR和FI 为标识，通过二次曲线分析确定生长中期草鱼（266～716 g）饲料中包被复合微量元素最适添加水平分别为239.32 和241.20 mg/kg。

表4 添加包被复合微量元素对生长中期草鱼生产性能的影响Table 4 Effects of the coated slow-release multi-trace elements on the growth performance in young grass carp （Ctenopharyngodon idella）

2.2 包被复合微量元素和常规微量元素对生长中期草鱼消化酶活力和CCK 的影响

由表5 可知，生长中期草鱼全肠胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，前肠CCK 含量先随饲料中包被复合微量元素添加水平的增加而显著升高（P＜0.05），当饲料中包被复合微量元素添加水平均为300 mg/kg时达到最大值，而后随着饲料中包被复合微量元素添加水平的进一步增加而显著降低（P＜0.05）。生长中期草鱼全肠糜蛋白酶活力随饲料中包被复合微量元素添加水平的增加而显著提高（P＜0.05）。回归分析表明：饲料中包被复合微量元素添加水平（x）与生长中期草鱼前场 CCK 含量（YCCK，PI）呈极显著二次曲线关系，回归方程为yCCK，PI=-6.778E-4x2+0.275x+161.113（R2=0.659，P＜0.01）。与常规微量元素组相比，包被复合微量元素组（生产性能最佳，300 mg/kg）生长中期草鱼全肠胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力显著高于常规微量元素组（P＜0.05），而前肠CCK 含量与常规微量元素组差异不显著（P＞0.05）。

2.3 包被复合微量元素和常规微量元素对生长中期草鱼肠道刷状缘酶活力的影响

由表 6 可知，生长中期草鱼前肠AKP 和γ-GT活力先随饲料中包被复合微量元素添加水平的增加而显著提高（P＜0.05），当饲料中包被复合微量元素添加水平分别为300 和150 mg/kg 时，前肠AKP和γ-GT 活力达到最大值，而后随着饲料中包被复合微量元素添加水平的进一步增加，前肠AKP 和hγ-GT 活力均显著降低（P＜0.05）。饲料中添加不同水平包被复合微量元素对生长中期草鱼中、后肠AKP 活力，前、中、后肠 CK、Na+，K+-ATP 酶和后肠 γ-GT 活力影响的变化趋势与前肠AKP 相似，而中肠γ-GT活力与前肠γ-GT 活力的变化趋势一致。回归分析表明：饲料中包被复合微量元素添加水平（x）分别与生长中期草鱼的中肠 AKP 酶活力（yAKP，MI）、前、中、后肠 CK（yCK，PI，MI，DI）和 γ-GT（yγ-GT，PI，MI，DI）活力呈极显著二次曲线关系，回归方程分别为yAKP，MI=-6.059E-4x2+0.280x+50.617（R2=0.768，P＜0.01）、yCK，PI=-1.079E-3x2+0.512x+116.792（R2=0.822，P＜0.01）、yCK，MI=-3.957E-4x2+0.185x+87.962（R2=0.708，P＜0.01），yCK，DI=-5.800E-3x2+0.278x+58.838（R2=0.783，P＜0.01）、yγ-GT，PI=-9.087E-34x2+0.401x+128.101（R2=0.757，P＜0.01）、yγ-GT，MI=-1.299E-3x2+0.583x+99.488（R2=0.798，P＜0.01）、yγ-GT，DI=-8.675E-4x2+0.431x+62.132（R2=0.750，P＜0.01）。与常规微量元素组相比，包被复合微量元素组（生产性能最佳，300 mg/kg）生长中期草鱼前、中、后肠AKP、CK 以及前、后肠Na+，K+-ATP 酶和γ-GT 活力显著高于常规微量元素组（P＜0.05），而中肠 Na+，K+-ATP 酶和 γ-GT 活力与常规微量元素组差异不显著（P＞0.05）。

表5 添加包被复合微量元素对生长中期草鱼全肠消化酶活力和前肠胆囊收缩素含量的影响Table 5 Effects of coated slow-release multi-trace elements on the digestive enzyme activities （U/g tissue）in the whole intestine and cholecystokinin （CCK） content （ng/g protein） in the proximal intestine of young grass carp （Ctenopharyngodon idella）

表6 添加包被复合微量元素对生长中期草鱼肠道刷状缘酶活力的影响Table 6 Effects of coated slow-release multi-trace elements on the brush-border enzyme activities in the intestine of young grass carp （Ctenopharyngodon idella） U·g-1

2.4 包被复合微量元素和常规微量元素对生长中期草鱼肠道生长发育指标的影响

由表7 可知，生长中期草鱼肠重、肠长、肠蛋白含量以及前、中、后肠皱襞高度先随饲料中包被复合微量元素添加水平的增加而显著提高（P＜0.05），当饲料中包被复合微量元素添加水平达到300 mg/kg时，生长中期草鱼肠重、肠长、肠蛋白含量以及前、中、后肠皱襞高度达到最大值，而后随着饲料中包被复合微量元素的进一步增加显著降低（P＜0.05）。饲料中添加包被复合微量元素对生长中期草鱼ISI和RGL 没有影响（P＞0.05）。回归分析表明：饲料中包被复合微量元素添加水平（x）分别与生长中期草鱼前、中、后肠皱襞高度（yFoldheight，PI，MI，DI）呈极显著二次曲线关系，回归方程分别为yFoldheight，PI=-8.714E-3x2+4.413x+1181.773（R2=0.801，P＜0.01）、yFoldheight，MI=-7.506E-3x2+3.554x+1047.894（R2=0.859，P＜0.01）、yFoldheight，DI=-5.308E-3x2+2.471x+887.550（R2=0.801，P＜0.01）。与常规微量元素组相比，包被复合微量元素组（生产性能最佳，300 mg/kg）生长中期草鱼肠重、肠蛋白含量以及前、中、后肠皱襞高度显著高于常规微量元素组（P＜0.05），而 ISI、肠长和 RGL 与常规微量元素组差异不显著（P＞0.05）。

2.5 包被复合微量元素和常规微量元素对生长中期草鱼肠道微生物的影响

由表8 可知，生长中期草鱼肠道乳酸杆菌和芽孢杆菌数量先随饲料中包被复合微量元素水平的增加而显著提高（P＜0.05），当饲料中包被复合微量元素添加水平均达到300mg/kg 时，肠道乳酸杆菌和芽孢杆菌数量达到最大值，而后随着饲料中包被复合微量元素的进一步增加显著降低（P＜0.05）。饲料中添加包被复合微量元素对生长中期草鱼肠道大肠杆菌和嗜水气单胞菌的影响与肠道乳酸杆菌的趋势相反（P＜0.05）。回归分析表明：饲料中包被复合微量元素添加水平（x）分别与生长中期草鱼肠道乳酸杆菌（yLactobacillus）、芽孢杆菌（yBacillus）、大肠杆菌（yEscherichiacoli）和嗜水气单胞菌（yAeromonas）数量呈极显著二次曲线关系，回归方程分别为yLactobacillus=-1.164E-5x2+0.006x+6.267（R2=0.845，P＜0.01）、yBacillus=-1.059E-5x2+0.005x+6.382（R2=0.866，P＜0.01）、yEscherichiacoli=1.083E-5x2-0.005x+6.519（R2=0.753，P＜0.01）、yAeromonas=7.912E-6x2-0.004x+6.676（R2=0.799，P＜0.01）。与常规微量元素组相比，包被复合微量元素组（生产性能最佳，300 mg/kg）生长中期草鱼肠道乳酸杆菌和芽孢杆菌数量显著高于常规微量元素组（P＜0.05），而大肠杆菌和嗜水气单胞菌数量显著低于常规微量元素组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 包被复合微量元素与常规微量元素对生长中期草鱼生产性能的比较研究

微量矿物元素是鱼类健康生长所需的微量元素[7]，缺乏将引起鱼类疾病抵抗力下降、生长受阻、肌肉品质变差[12-17]。本试验结果显示，饲料中添加包被复合微量元素提高了生长中期草鱼FBW、WG 和SGR，促进鱼类生长，且与常规微量元素组相比，生产性能最佳包被复合微量元素组（300 mg/kg）生长中期草鱼FBW、WG 和SGR 分别显著高于常规微量元素组。饲料中包被复合微量元素添加水平分别与生长中期草鱼的WG 和SGR 呈极显著二次曲线关系，当饲粮中包被复合微量元素低于300 mg/kg 时，可能由于其提供的微量元素不足，导致鱼类微量元素缺乏，不能满足生长中期草鱼生长需要，进而降低了生长中期草鱼WG 和SGR。当饲粮中包被复合微量元素添加水平超过 300 mg/kg（Mn，17.10 mg/kg）时，可能导致饲料中Mn 等部分微量元素的过量。Tang R.等[16]研究表明：当饲粮中Mn 含量超过18.24 mg/kg时，显著降低生长中期草鱼（264 g）的SGR。此外，与常规微量元素组比较，虽然150 mg/kg 包被复合微量元素组饲料中 Cu、Fe、Mn、Zn、Se 和 I 含量仅为常规微量元素组的 31%、14%、71%、40%、12%和75%，但对生长中期草鱼的促生长效果则显著优于常规微量元素（P＜0.05），说明包被复合微量元素在鱼上的生物学效价可能优于常规微量元素。目前，关于包被复合微量元素在鱼上的研究未见报道。在陆生动物上的零星研究表明，包被复合微量元素对黄羽肉鸡和育肥猪日增重的作用效果优于常规微量元素[3-4]，与本试验结果相似。包被复合微量元素促进鱼类生长的原因一方面可能由于通过物理隔离，消除微量元素间的氧化作用，并在饲料加工和贮存过程中减少了对饲料中脂肪、维生素和氨基酸等营养素的氧化破坏作用[18]；另一方面，通过物理包被工艺可能减小了无机金属离子对动物消化道黏膜的刺激损伤，改善了饲料适口性，提高动物采食量。本试验结果表明：饲料中添加300 mg/kg 包被复合微量元素显著提高了生长中期草鱼FI，降低FC，且与常规微量元素组相比，包被复合微量元素组（300 mg/kg）生长中期草鱼FI 和FC 分别显著高于或低于常规微量元素组，该结果与在育成猪上的研究结果类似[3]。张海涛等[19]研究发现，包被锌促进凡纳滨对虾对饲料中蛋白质的消化吸收。这些结果说明，包被复合微量元素对鱼类的促生长作用可能与其提高了鱼类的采食量和饲料利用率有关，且作用效果优于常规微量元素。分别以SGR 和FI 为标识，生长中期草鱼（266～716 g）饲料中包被复合微量元素最适添加水平分别为239.32 和241.20 mg/kg。

3.2 包被复合微量元素与常规微量元素对生长中期草鱼消化吸收能力和肠道生长发育的比较研究

鱼类FI 和饲料利用率的提高通常与其消化吸收能力的增强有关[14]。肠道是鱼类消化吸收营养物质的主要场所，肠道内消化酶活力可反映鱼类的消化能力[9]。本试验结果表明：饲料中添加包被复合微量元素可提高生长中期草鱼肠道胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，且与常规微量元素组相比，包被缓释微量元素组（300 mg/kg）这些酶的活力均显著高于常规微量元素组，说明包被复合微量元素提高鱼类对饲料中蛋白质、脂肪和淀粉的消化能力，且作用效果优于常规微量元素。然而，关于包被复合微量元素对动物消化酶活力的影响未见研究报道。鱼类肠道内的消化酶来源于胰腺合成消化酶的外分泌[20]。CCK 是调节胰腺外分泌的胃肠多肽，具有很强的促胰酶（如胰蛋白酶等胰消化酶）释放作用，在鱼上主要由其前肠分泌[9，21]。本试验结果表明，包被复合微量元素显著提高生长中期草鱼前肠CCK 含量，说明包被复合微量元素可能通过促进胰腺消化酶的分泌，进而提高肠道内消化酶的酶量。然而，包被复合微量元素组（300 mg/kg）与常规微量元素对生长中期草鱼肠道CCK 含量没有显著影响，说明鱼类肠道CCK 的分泌可能与微量元素的添加形式无关，但其可能的作用方式需要进一步研究。

鱼类对营养物质的吸收能力与鱼类肠道刷状缘酶活力有关。AKP 是一种膜结合蛋白，在生物体内分部广泛，其中分布于动物肠道上皮刷状缘细胞表面的肠型AKP 与维生素D、钙、氨基酸、脂类和葡萄糖等多种营养物质的吸收有关。CK 通过促进ATP 生成，为动物肠道吸收营养物质提供能量。Na+，K+-ATPase 与大部分氨基酸和葡萄糖的吸收有关。γ-GT 能促进动物肠道氨基酸向细胞内的转运。因此，CK、Na+，K+-ATPase 和 γ-GT 常用于评价鱼类肠道吸收能力。本试验结果表明，饲料中添加包被复合微量元素可提高生长中期草鱼前、中、后肠CK、Na+，K+-ATPase 和 γ-GT 活力。此外，与常规微量元素组相比，包被复合微量元素组（300 mg/kg）生长中期草鱼前、中、后肠AKP 和CK 活力以及前、后肠Na+，K+-ATPase 和 γ-GT 活力显著提高，而中肠Na+，K+-ATPase 和 γ-GT 活力与常规微量元素组差异不显著。结果说明，包被复合微量元素可能通过提高鱼类肠道消化吸收酶活力，进而提高了鱼类的消化吸收能力，且作用效果显著优于常规微量元素。另一方面，鱼类的消化吸收能力还与其肠道的吸收面积大小有关，肠道皱襞高度是反映鱼类肠道吸收面积的重要指标。本试验结果表明，饲料中添加包被复合微量元素提高了生长中期草鱼前、中、后肠肠道皱襞高度，且与常规微量元素组比，包被复合微量元素组（300 mg/kg）生长中期草鱼前、中、后肠肠道皱襞高度显著高于常规微量元素组，结果说明包被复合微量元素可能通过提高了鱼类肠道吸收面积进而促进了鱼类的消化吸收能力，且作用效果优于常规微量元素。

鱼类肠道消化吸收能力的增强通常依赖于肠道的正常生长发育。肠重、ISI、肠长、RGL 和肠蛋白含量是评价鱼类肠道生长发育的重要指标。本试验结果表明，饲料中添加包被复合微量元素可提高生长中期草鱼肠重、肠长和肠蛋白含量，且与常规微量元素组比较，包被复合微量元素组（300 mg/kg）生长中期草鱼肠重、肠长和肠蛋白含量显著提高，说明包被复合微量元素促进了鱼类肠道生长发育，且作用效果优于常规微量元素组。

3.3 包被复合微量元素与常规微量元素对生长中期草鱼肠道微生物菌群的比较研究

鱼类肠道正常微生物群落不仅参与机体的防御，维护机体健康，同时在营养物质的消化吸收中发挥着不可缺少的作用[22-23]。乳酸杆菌通过分泌代谢产物、竞争排斥、免疫调节等多种方式抑制大肠杆菌等肠道有害菌调节肠道微生物区系平衡，增强动物肠道屏障和免疫功能，促进肠道生长发育[24]。鱼类肠道中的正常菌群如芽孢杆菌等可分泌多种消化酶，进而促进宿主对一些营养物的消化[25]。本试验结果发现，饲料中添加包被复合微量元素增加了生长中期草鱼肠道有益微生物乳酸杆菌和芽孢杆菌数量，减少了有害微生物大肠杆菌和嗜水气单胞菌数量，且常规微量元素组的比较，包被复合微量元素（300 mg/kg）对鱼类肠道微生物调节的作用效果优于常规微量元素。喻哲昊[3]在育肥猪上的研究显示，与常规微量元素组相比，包被复合微量元素组显著提高了育肥猪肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，而大肠杆菌数量显著减低，与本试验结果类似。微量元素促进动物乳酸杆菌和芽孢杆菌的生长可能与其营养作用有关。研究表明：大量微生物的生长依赖于较高水平的微量元素（如铁、锰、锌等）[26]。而微量元素抑制有害菌大肠杆菌和嗜水气单胞菌数量可能与其促进了乳酸杆菌的生长有关。一方面，乳酸杆菌可通过分泌代谢产物、竞争排斥、免疫调节等多种方式抑制大肠杆菌等肠道有害菌的生长[24]。另一方面，乳酸杆菌能分泌p-hydroxyphenyllactic acid（HPLA）分子将 Fe3+还原为 Fe2+，促进动物肠上皮细胞对铁离子的吸收，进而降低有害菌利用铁的概率[27]。包被复合微量元素对肠道微生物的作用优于常规微量元素可能部分与其缓释作用有关。这些结果说明包被复合微量元素促进了肠道有益菌乳酸杆菌和芽孢杆菌的增殖，降低了肠道有害菌大肠杆菌和嗜水气单胞菌的增殖，从而发挥肠道微生物的益生作用，且作用效果优于常规微量元素。