正交试验优选鼻舒宁温敏凝胶提取工艺

原 泉 李传勋2 吕 佳* 周艺璇

1.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600；2.大连医科大学药理教研室，辽宁 大连 116044

过敏性鼻炎(lergic rhinitis，AR)属中医鼻鼽范畴，主要症状有鼻痒、鼻塞、打喷嚏、流鼻涕等，是一种常见的多发性鼻病[1]。过敏性鼻炎病因分为外因与内因。外因多为气候变化、环境污染、风寒及火热之邪内侵[2]。内因则多责之于肺脾肾三脏功能失调。过敏性鼻炎虽然不会给患者带来严重的健康和生命安全威胁，但是却会导致患者出现情绪失调、疲劳、食欲减退、注意力减退、睡眠紊乱以及学习障碍等问题，降低患者生活质量，所以必须重视过敏性鼻炎的临床治[3]。

鼻用温敏凝胶(nasal thermosensitive in situ ge1)是指以溶液状态制备和给药，在用药部位因温度变化刺激而发生相转变，形成凝胶化半固体的制剂，独特的溶液—凝胶转变性质兼有制备简单、使用方便，可延长药物在鼻腔内的滞留时间等优点[4]。泊洛沙姆(poloxamer)是目前研究较为深入的一类温敏型高分子凝胶材料，具有良好的生物相容性[5]。此次实验根据鼻腔的生理特点，制备鼻舒宁温敏型原位凝胶，以期延长药物在鼻黏膜上的滞留时间，从而提高药物的生物利用度。

中医外治法不但能够有效控制过敏性鼻炎的症状，而且还可以有效降低复发率。鼻舒宁温敏凝胶由麻黄、白芷、皂角等八味中药组成，临床上治疗过敏性鼻炎有良好的疗效。本试验以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱提取量为考察指标, 通过正交试验, 优选鼻舒宁凝胶提取工艺条件, 为该制剂的制备工艺研究提供依据。

1 仪器与试药

岛津LC-2010HT高效液相色谱仪(包括四元泵、VWD检测器，自动进样器，lab solution 化学工作站)，日本岛津有限公司；AE240型十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品(批号：171241-201809、171237-201510)，中国食品药品检定研究院；乙腈色谱纯，水为二次蒸馏水，其余所用试剂皆为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：月旭Welch ultimate XB-C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.02 mol/mL磷酸二氢钾溶液(每100 mL加入0.28 mL三乙胺，磷酸调节pH值到3) (5∶95 )；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm。

2.1.2 对照品溶液的制备 对照品储备溶液制备：精密称定盐酸麻黄碱对照品0.01060 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。浓度为：0.1060 mg/mL。精密称定盐酸伪麻黄碱对照品0.00692 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。浓度为：0.0692 mg/mL。

对照品溶液制备：精密量取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品溶液各5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。浓度分别为：盐酸麻黄碱0.0530 mg/mL、盐酸伪麻黄碱0.0346 mg/mL。

2.1.3 供试品溶液的制备 分别精密吸取各试验项下提取液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 um微孔滤膜滤过，取续滤液,作为供试品溶液。

2.1.4 线性关系考察 依次吸取“2.1.2”项下制备好的混合对照品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.1.1”项下的色谱条件分别进样，记录其各自的峰面积。以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的进样量(μg)为横坐标，各自的峰面积为纵坐标，绘制曲线，求得回归方程分别为：Y=2215237X+8658.343，r=0.999925；Y=2313705X-5101.35，r=0.999978。结果表明，在盐酸麻黄碱在0.0530～1.0600 μg，盐酸伪麻黄碱在0.0346～0.6920 μg的范围内进样，进样量与峰面积成良好的线性关系，如图1所示。

2.1.5 含量测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 μL,注入液相色谱仪,测定峰面积,以外标法计算含量。

2.2 提取工艺的考察

2.2.1 正交试验因素与水平设计 方中麻黄为君药，其中主要含有盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱[6-7]。采用正交试验优化提取工艺，以方中君药麻黄中所含盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱提取量为考察指标，对影响提取效果的提取次数、提取时间、溶媒用量因素进行考察，因素水平见表1。采用 L9(34)正交表安排试验。

表1 因素与水平表

水平A B C 提取次数/次 提取时间/h溶媒用量/倍 110.56,4,4 221.08,6,6 331.510,8,8

2.2.2 正交试验设计 提取液的制备：分别取处方量的麻黄、白芷、川芎等药材，按正交试验表安排试验，进行提取，滤过，即得正交试验提取液1～9号。按2.1.1项下色谱条件，分别测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量，计算正交试验提取液1～9号中指标成分的含量，记录各份提取液体积。结果见表2、3。

表2 L9(34)试验安排与结果

表3 方差分析

由方差分析可知，以盐酸麻黄碱、伪麻黄碱总含量为指标时，提取次数(A)和提取时间(B)有显著性差异。由直观分析可知，提取次数(A)和提取时间(B)的2、3水平优于1而且两者差异小，结合实际生产，确定最优提取工艺为A2B3C2,即加8、6倍量的水回流提取2次，每次1.5 h，麻黄碱、伪麻黄碱总转移率高于80%。

2.2.3 验证试验 取同批复方药材3份，分别按照最优提取工艺进行试验，制得的样品测定盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量。结果见表4。

表4 验证试验 (n=3)

2.3 阴性供试品溶液的制备 取处方中除麻黄外的其余药味，按优选出的提取工艺提取，得到提取液，同供试品溶液的制备方法处理，制得阴性供试品溶液。

2.4 专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，并分别记录色谱图，结果显示阴性供试品对该实验无干扰，如图2、图3、图4所示。

2.5 稳定性试验 取供试品溶液适量，按“2.1.1”项下分别在0、2、6、8、12、24 h依次进样10 μL，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱峰面积的RSD分别为0.50%、0.76%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下连续进样6次，记录色谱图，测定峰面积，RSD分别为0.27%、0.24%，表明仪器有良好的精密度。

2.7 重复性试验 取同一批样品6份，每份5 mL，按供试品溶液制备方法制备样品，并依法测定计算含量及RSD，结果盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的RSD分别为0.71%、1.15%(n=6)。表明该法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品2.5 mL，共6份，至10 mL量瓶中，依次加入盐酸麻黄碱对照品溶液(0.0530 mg/mL)3 mL和盐酸伪麻黄碱对照品溶液(0.0346 mg/mL)3 mL，按供试品制备方法制样，按“2.1.1”项下进样进行分析，计算回收率，结果得盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的平均回收率分别为101.94%和102.12%，RSD分别为1.31%和2.37%。

3 讨论

3.1 测定目标成分的选择 麻黄为方中君药，麻黄中盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱的含量最高，研究表明，盐酸伪麻黄碱可选择性地收缩上呼吸道毛细血管，消除鼻咽部黏膜充血、肿胀、减轻鼻塞等症状。对麻黄等药材的提取工艺中，往往只局限于以麻黄碱含量为指标进行工艺的优选，具有一定的局限性; 本实验增加了伪麻黄碱的含量测定。本实验以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量之和为指标，优选最佳提取工艺。

3.2 方法考察 采用紫外分光光度法对其进行全波长扫描，确定210 nm处有最大吸收波长。查阅文献[8-10]，确定HPLC法的液相条件为乙腈-0.02 mol/mL磷酸二氢钾溶液，该方法能够缩短盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的出峰时间。并考虑使用三乙胺防止峰拖尾。在紫外波长范围内，磷酸的紫外吸收干扰比乙酸弱。在低吸收波长处，乙酸在220 nm左右有吸收，会干扰吸收峰，故选用磷酸调节PH值，优化峰型。

3.3 柱温考察 分别考察柱温为25 ℃、30 ℃、35 ℃等间隔的不同温度对盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱色谱行为的影响，结果发现不同温度对两者的系统适应性考察参数及保留时间无明显影响，故柱温最终为30℃。

3.4 流速考察 分别选择流速为0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min等流速对盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱色谱行为的影响，结果显示不同流速对两者的系统适应性参数和保留时间无明显影响，故流速最终为1.0 mL/min。

3.5 提取参数的确定 因盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱均具有挥发性，故回流提取的温度不宜过高。因此不将温度梯度作为正交试验的考察因素。前期试验及文献[11-13]查阅确定了提取的次数、时间、溶媒量水平。

实验结果显示，液相条件小的变动对指标成分的峰型，分离度，保留时间均影响较小，此色谱条件可靠，可用于日常含量测定。采用正交设计的方法优化出最佳的提取工艺为加8、6倍量的水提取2次，每次提取1.5 h，且验证试验证明回流方法的提取率大于80%。