细胞块结合免疫组化技术在恶性胸腔积液病理诊断中的应用

赵 帅，肖 琳

(长沙市第三医院病理科，湖南 长沙 410015)

胸腔积液的原因复杂，常见的原因有结核、感染、肿瘤等[1-2]。常规的诊断方法是细胞学涂片，但是该方法存在肿瘤细胞与增生的间皮细胞不易鉴别的问题，部分病例也会因含血液成分较多而有诊断意义的细胞量少而难以诊断，并且无法判断组织来源。本研究采用胸腔积液沉渣做细胞块，并应用免疫组化等方法进行检测，探讨细胞块结合免疫组化技术在恶性胸腔积液原发疾病肺癌的病理分型诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2012年1月至2018年6月我院病理科归档的确诊的恶性胸腔积液的具有常规细胞学涂片和细胞块资料的患者50例，其中男29例，女21例；年龄48～80岁，中位年龄64岁；原发肿瘤肺癌的组织学分型：腺癌30例，鳞癌12例，小细胞癌8例。所有病理资料均经高年资病理科医师复核。

1.2 细胞学涂片将标本静置6～12 h，移去上清液，取50 mL入试管内离心，2 000 r·min-1离心5 min后，弃去上清液，将底部约0.5 mL细胞液混匀，均匀涂于载玻片上，然后体积分数95%乙醇固定10～30 min，然后进行HE染色。

1.3 细胞块的制作将胸腔积液放入50 mL的离心管中，2 500 r·min-1离心10 min，反复数次离心留取底部沉渣部分，移去上清液并加入质量分数4%中性多聚甲醛固定液离心静置1 h，然后取沉淀物放入包埋盒内常规脱水包埋，4 μm切片，然后进行HE染色。

1.4 免疫组化染色将50例恶性胸腔积液细胞块切片进行免疫免疫组化分析。本实验的抗体及DAB显色试剂均购自广州深达生物技术有限公司。实验采用免疫组化染色方法，操作过程严格按照说明书进行。细胞蜡块切4 μm切片，常规烤片1 h脱蜡至水，过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，微波抗原修复，加入一抗4 ℃孵育过夜，DAB显色，苏木素复染，PBS代替一抗作阴性对照。

1.5 结果判定免疫组化的结果：癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、细胞角蛋白7(Cell Keratin 7，CK7)、天冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、淋巴细胞抗原(lymphocyte antigen，CD56)、嗜铬素A(chromogranin A，CgA)、细胞角蛋白5/6(cytokeratin，CK5/6)阳性表达为细胞质和细胞膜出现阳性颗粒，甲状腺转录因子-1(Thyroid transcription factor,TTF-1)、肾母细胞瘤基因(Nephroblastoma gene,WT-1)、P63阳性表达为细胞核出现阳性颗粒。

1.6 统计学处理采用SPSS 13.0进行统计学处理，计数资料用百分数表示，比较用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

腺癌中CEA阳性表达率80.00%、CK7为86.66%、NapsinA为90.00%、CD56为0.00%、CgA为10.00%、CK5/6为0.00%、TTF-1为100.00%、WT-1为10.00%、P63为16.66%；鳞癌中CEA阳性表达率25.00%、CK7为16.66%、NapsinA为0.00%、CD56为0.00%、CgA为16.66%、CK5/6为100.00%、TTF-1为8.33%、WT-1为16.66%、P63为100.00%；小细胞癌中CEA阳性表达率25.00%、CK7为12.50%、NapsinA为0.00%、CD56为100.00%、CgA为100.00%、CK5/6为0.00%、TTF-1为87.50%、WT-1为12.50%、P63为0.00%。见表1。

表1 不同组织类型肺癌恶性胸腔积液细胞块中各指标的表达

3 讨论

很多肺癌患者在未发现原发病灶之前主要表现为胸腔积液，如何能够明确胸腔积液的性质，在明确性质后如何对肺癌进行组织学分型具有重大意义。美国国立综合癌症网络指南对非小细胞肺癌的治疗方案也根据病理分型而制定[3]。

本实验采用的是胸腔积液离心制作细胞块的方法，此方法相对于传统涂片更具有优势。传统的涂片检查方法是将标本静置后进行直接细胞学涂片，查找具有诊断意义的细胞，但是这种方法送检标本细胞密度低且混有红细胞及炎性渗出物等造成细胞涂片厚度不均匀，细胞多层重叠，容易造成恶性肿瘤的漏检[4]。做成细胞块连续切片能够较好的保留组织学结构，如腺管、腺泡、乳头结构等[5-6]，且细胞块为将来的免疫组化及基因检测提供了较好的组织基础和可操作性，从本实验的胸腔积液细胞块HE切片中可以看出腺癌很多时候可以看到腺管状、乳头状结构，鳞癌也可以看到类似组织学的结构特点，小细胞癌可以看到挤压变形的肿瘤细胞，当然这种HE切片的形态学观察依然有些主观，为了更精准分型，以满足临床上制定治疗方案的需求，我们在此基础上进行了免疫组化检查，采用CEA、CK7、NapsinA、CD56、CgA、CK5/6、TTF-1、WT-1、P63等抗体进行检测并探讨其诊断的价值。结果显示，腺癌中阳性率较高的抗体是TTF-1、CK7、NapsinA及CEA，TTF-1是一种相对分子质量38 000～40 000的核蛋白，在胎儿肺组织及成人的Ⅱ型肺泡上皮中存在，大多数肺腺癌、肺小细胞癌免疫组化显示TTF-1阳性，而在肺鳞癌中阴性[6]。本研究显示不同病理类型的肺癌中，腺癌中TTF-1阳性率100.00%，与文献相符。NapsinA是一种胃酶样天门冬氨酸蛋白酶，是肺腺癌的一种新标志物[7]，本研究结果显示，NapsinA阳性率90.00%,而在鳞癌和小细胞癌中均是阴性，说明其敏感性和特异性均较好，是一种好的腺癌标志物。本研究结果还显示CK7、CEA在腺癌中的表达较好，特别是CK7在腺癌中表达高，鳞癌及小细胞癌表达低，也是具有较高的诊断应用价值。鳞癌中阳性率较高的抗体是CK5/6和P63，p63作为鳞癌的标记物，敏感性极高且阳性定位于细胞核，CK5/6阳性定位于细胞浆和细胞膜，本研究结果显示p63和CK5/6在鳞癌中阳性率为100.00%，且CK5/6在腺癌和小细胞中均未见表达，可见其敏感性和特异性均较高。小细胞癌中阳性率较高的抗体是CD56和CgA。肺神经内分泌肿瘤推荐的免疫组化标志物为CgA、CD56和Syn，我们的研究结果也证实，在胸腔积液细胞块中的肿瘤细胞做免疫组化，小细胞癌中阳性率较高的也是CD56和CgA。

总之，通过我们的研究显示，通过细胞块结合免疫组化的方法可以明显提高胸腔积液直接涂片法的准确率，在形态学倾向腺癌时可以选择TTF-1、CK7、NapsinA及CEA; 倾向鳞癌时可以选择P63和CK5/6，倾向小细胞癌时可以选择CD56和CgA。这些抗体在敏感性核和特异性都具有很好的应用价值。而且通过细胞块的制作也为基因检测做了基础，当然其对于基因检测的应用价值还需要进一步检测。