铜绿假单胞菌整合子分布差异与耐药性的关系*

徐令清,黄圳婷,汤英贤,李玉珍,温伟洪,陈凌娟,王 欢,李介华

(广州医科大学附属第六医院/清远市人民医院检验科，广东清远 511518)

铜绿假单胞菌(PA)具有内在广泛耐药属性，是临床上比较常见的条件致病菌。碳青酶烯类抗菌药物如亚胺培南等具有抗菌谱广、抗菌活性强等特点。有研究表明，亚胺培南显示出对PA良好的抗菌活性，是治疗PA的首选药物[1]，但随着抗菌药物在临床上广泛应用，PA耐药情况也日益严峻,尤其是耐碳青酶稀类铜绿假单胞菌(CRPA)[2]，给临床的防治工作带来很大困难。研究发现，整合子已成为细菌产生和传播耐药性的重要机制[3]。本研究对临床分离的68株PA中整合酶基因及可变区基因盒进行检测，以探讨整合子携带与细菌耐药的关系，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集本院2017年1～12月临床分离的非重复PA 共68株。68株PA科室分布存在差异,其中ICU 23株、脑科12株、呼吸内科9株、胃肠外科8株、肝胆外科4株、儿科3株、烧伤科3株，其余科室6株。其中整合子阳性7株，分布在呼吸内科3株、ICU 3株和脑科1株。按2016年美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准判断结果，最低抑菌浓度(MIC)≥8 μg/mL判定为亚胺培南或美罗培南耐药，对二者之一耐药确定为CRPA； MIC<8 μg/mL为碳青霉烯类敏感。其中CRPA共27株，碳青酶烯类敏感PA有41株。其中，分离自痰液43株(63.24%)，伤口分泌物8株(11.76%)，中段尿5株(7.36%)，胆汁4株(5.88%)，引流液2株(2.94%)，血液2株(2.94%)，其他4株(5.88%)。质控菌株为铜绿假单胞菌 ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC25922。整合子阳性对照菌株为肺炎克雷伯菌，通过上海生工生物有限公司测序确定后保留。

1.2仪器与试剂 仪器：BD phoenix100全自动细菌鉴定仪(美国BD公司)；T100TM PCR扩增仪、电泳仪、Gel DoxTM XR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。试剂：哥伦比亚血琼脂平板(广州迪景微生物科技有限公司)；细菌组DNA提取试剂盒，2×Taq PCR MasterMix，Gel Red核酸染料和Marker Ⅰ、Ⅲ DNA Ladder(北京天根生化科技有限公司)；引物(上海英骏生物技术有限公司合成)。

1.3方法

1.3.1细菌总DNA提取 按细菌组DNA提取试剂盒说明书提取总DNA，使用核酸蛋白检测仪检测总DNA浓度和纯度，260 nm和280 nm光密度(OD)比值(OD260/OD280)为1.7～1.9时为合格，浓度调整为约50 ng/μL，于-80 ℃保存。

1.3.2整合酶基因PCR检测 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子整合酶基因(分别为Int 1、2、3)PCR反应体系[4]为：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，其中包含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等，上、下游引物各0.5 μL(10 ng/μL)，DNA模板0.5 μL(模板浓度10 ng/μL)，补充ddH2O至25.0 μL；反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，26个循环；72 ℃延伸5 min。取5 μL产物点样在2%琼脂糖凝胶中电泳60 min，电压为80 V，以100～1 200 bp的MarkerⅡDNA Ladder作为参照，凝胶成像系统分析并处理结果。参照文献[4]，Int 1、2、3及可变区所用的引物序列见表1。

1.3.3可变区PCR检测 整合子可变区PCR反应体系[5]为：2 × Taq PCR MasterMix 25.0 μL，上、下游引物各0.5 μL(10 ng/μL)，DNA模板1.0 μL，补充ddH2O至50.0 μL；反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。取5 μL产物点样在1.2%琼脂糖凝胶中电泳60 min，以200～4 500 bp的MarkerⅢDNA Ladder作为参照，电压为80 V，凝胶成像系统分析并处理结果。

1.3.4可变区测序分析 可变区PCR产物由上海生工生物有限公司纯化和测序，测序图谱结果使用Chromas软件进行序列拼接校正，使用BLAST(www.pubmed.com)进行比对分析，选择匹配度最高结果。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1IntI 1、2、3分布 68株PA中共检出IntI 1 7株，检出率为10.29%(7/68)，未检出IntI 2、3。检出27株CRPA，其中IntI 1 7株，检出率为25.9%(7/27)；在碳青酶烯类敏感PA中未检出Ⅰ类整合子整合酶基因。部分菌株整合子整合酶基因PCR结果见图1。

表1 三类整合子中整合酶基因及可变区的引物序列

IntⅠ 1、2、3分别对应Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子中5′-保守末端的整合酶基因，若其出现阳性表达，则代表对应整合子阳性

M：MarkerⅡDNA Ladder(100～1 200 bp)；1～7：IntI 1基因阳性菌株；8：阳性对照；9：IntI 1基因阴性菌株；10：空白对照

图1部分Ⅰ类整合酶基因PCR扩增结果

2.2Ⅰ类整合子与各种抗菌药物耐药率的关系 Ⅰ类整合子阳性菌株对各类抗菌药物耐药率除粘菌素外均高于Ⅰ类整合子阴性菌株，其差异除了氨曲南外均有统计学意义(P<0.05),见表2。Ⅰ类整合子阳性检出率与耐药性相对危险度(RR)分析见表3。

表3 Ⅰ类整合子阳性检出率与耐药性RR分析

2.3整合子可变区扩增结果 7株Ⅰ类整合子阳性菌株经过PCR及电泳后，出现明显条带的有6株，其片段长度在2 000～5 000 bp之间，大小不等，见图2；其余20株CRPA也进行了可变区扩增，显示有3株在500～800 bp处也出现条带。见图3。

M：Marker Ⅲ DNA Ladder(200～4 500 bp)；1、2、4～7：整合子可变区阳性标本；3：可变区阴性标本；8：空白对照

图27株Ⅰ类整合子阳性菌株可变区PCR结果

M：Marker Ⅲ DNA Ladder(200～4 500 bp)；3、4、9：Ⅰ类整合子阴性CRPA可疑条带可变区

图3部分CRPA可变区PCR结果

2.5可变区基因盒测序结果 7株Ⅰ类整合子阳性菌株可变区产物及3株出现可疑条带可变区PCR产物共10株的测序结果显示，7株Ⅰ类整合子阳性菌株可变区有6株测序成功，其携带基因盒类型如表4所示。共检出12种耐药基因:ant(2″)-Ⅰa、aadA1、aadA4、aadB、aadA2、aadA15、blaVIM-2、blaVIM-3、blaOXA-2、arr-6、qnrVC1和cmlA15。其余3株可疑条带检测出4种耐药基因盒，分别是arr-2、cml45、blaOXA-10和aadA1。

表4 7株Ⅰ类整合子整合酶基因阳性菌株的耐药表型及可变区基因盒组合情况

a：碳青酶烯类(亚胺培南、美罗培南)；b：氨基糖苷类(阿米卡星、庆大霉素)；c：喹诺酮类(环丙沙星、左氧氟沙星)；d：头孢菌素类(头孢他啶、头孢吡肟)；e：广谱青霉素(哌拉西林)；f：青霉素/β-内酰胺酶抑制剂复合物(哌拉西林/他唑巴坦)；g：单环内酰胺类(西氟南)；-：未检出

3 讨 论

PA是临床上常见的条件致病菌。本研究收集的PA菌株中ICU检出率最高，为33.8%，可能是由于ICU中多为高龄、免疫力低下、各种较严重急慢性疾病患者，以及住院时间长、侵入性操作多等危险因素导致感染率增加[6]，所以医院要对ICU加强消毒管理和监测。碳青酶烯类抗菌药物如亚胺培南等是临床上常用于治疗PA的强效物，有报道称近年来其耐药率逐年上升[7]。本研究中CRPA检出率为39.7%(27/68)，而且在这些耐药菌中对其他种类抗菌药物如青霉素类、头孢菌素类和喹诺酮类等也有较高的耐药性，可能与诱导耐药有关。

整合子是一类可以通过位点特异性重组方式捕获、剪切、整合外源性耐药基因的DNA元件[8]，其被认为是导致抗菌药物抗性、毒性和致病性产生及扩散的移动元件[9]。其基本组成包括5′-保守末端、3′-保守末端及中间的可变区，可变区可在整合酶作用下插入一个或者多个耐药基因盒，使得细菌表现出相应耐药特征。根据5′-保守末端中编码整合酶的IntⅠ基因的不同，整合子目前可以分为6类，最常见的是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子。

本研究发现，68株PA中共检出Ⅰ类整合子7株，检出率为10.29%(7/68)，未检出Ⅱ类和Ⅲ类，比文献报道略低[10-13]，可能存在地区或选取菌株的差异。其中27株CRPA中Ⅰ类整合子阳性率(25.9%)比41株碳青酶烯类抗菌药物敏感菌株阳性率(0)高，Ⅰ类整合子阳性菌株对绝大多数抗菌药物耐药率均高于Ⅰ类整合子阴性菌株，差异有统计学意义(P<0.05)。通过RR分析发现，Ⅰ类整合子阳性菌株除粘菌素外耐药高于阴性菌株，除氨曲南外差异均有统计学意义(P<0.05)。由此可知，整合子的携带对细菌耐药起着重要作用，两者有着密切关系，因此在治疗中需要关注是否为整合子携带的致病菌感染。

目前在Ⅰ类整合子阳性菌株可变区中发现的耐药基因盒众多，本研究在6株Ⅰ类整个子阳性菌株的可变区中共检出12种耐药基因盒。其中ant(2″)-Ⅰa、aadA1、aadA4、aadB、aadA2、和aadA15为编码氨基糖苷类药物的耐药基因[14]；blaOXA-2、blaVIM-3和blaVIM-2为编码β-内酰胺类药物的耐药基因[15]；arr-6与利福平药物耐药有关；qnrVC1基因与喹诺酮类耐药有关； cmlA15基因与氯霉素耐药有关[16]。通过分析可变区测序结果，耐药基因和耐药表型具有较好的一致性，但也有些菌株表达了耐药表型却未检出耐药基因盒，如2、3、4和5号菌株都对喹诺酮类耐药，却未检出相应的耐药基因盒，可能存在其他耐药机制。

综上研究，整合子的携带与细菌耐药性有着密切的联系，应加强监测和减少抗菌药物滥用。整合子的研究，对于了解细菌耐药的发生和传播机制具有重要作用。