两步液液萃取-固相萃取净化结合高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中11种磺胺类兽药残留

刘培勇, 张 惠, 米之金, 张良成, 张光仁

(达州市食品药品检验所, 四川 达州 635000)

磺胺类(sulfonamides, SAs)药物是一类用于治疗细菌性感染疾病的广谱抗菌药,母核为对氨基苯磺酰胺,由此衍生出的化合物种类多达数千种,常用的有几十种,因具有抗菌谱广、高效、低毒、价格低廉等[1-3]特点,在临床及兽药领域应用十分广泛[3-5],从而存在药物滥用、误用及不遵守休药期规定等现象,造成很多动物源食品(水产品)中残存磺胺类药物及代谢产物;当这些代谢物在人体内积累到一定浓度时就会对人体的机能产生损害,破坏人体的造血系统,造成溶血性贫血,磺胺二甲基嘧啶等还存在潜在的致癌性[2]。据Baran等[6]报道丹麦在2009年每kg猪肉中磺胺类药物的平均使用量为4.82 mg,经统计分析,磺胺类兽药的使用量在所有肉类食品中处于中等偏上的水平,中国是猪肉消费大国,因此,加大猪肉中磺胺类兽药残留的日常监测十分必要。

随着国内外检测技术的不断发展,目前磺胺类药物的前处理和检测手段越来越多,前处理手段除了传统的液液萃取外,近年来出现了许多新的前处理方法,如固相萃取(SPE)法、超声辅助分散液液微萃取法[7]、磁性多壁碳纳米管法[8,9]、硅胶固载离子液体-基质固相分散法[10]、可视化蛋白质芯片法[11]、QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)法[12],宋伟等[9]利用增强型脂质去除净化剂(EMR)结合石墨化磁性多壁碳纳米管作为QuEChERS法吸附剂对克氏鳌虾进行前处理,测定了39种磺胺及喹诺酮类兽药残留,该方法为高脂肪含量的样品基质提供了一种新的方法,并且取得了较好的净化效果。液液萃取-固相萃取法是目前应用最广的前处理方法,通过不同类型的SPE小柱基本能够达到富集、净化的目的,Economou等[13]、刘铁铮等[14]、Wang等[15]采用不同SPE小柱分别对蜂蜜、鸡蛋和鸡肉基质中的磺胺做了加标回收试验,平均回收率都在70%～106%。磺胺的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[16]、液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[17,18]、毛细管电泳法[19]、酶联免疫法[20]。LC-MS/MS由于其灵敏度和选择性都高于其他检测器,目前被认为是效果最好的检测方法,其他方法都因其特异性强、适用范围窄且不适用于多类兽药残留的同时检测[21]而受到很大限制。

但是目前采用LC-MS/MS测定磺胺类兽药残留最主要的缺点仍然是提取物脂肪、蛋白质含量高,基质效应明显,尤其是一些新的方法,如QuEChERS法,在实现快速,高通量检测的同时,固然节约了不少时间,但对于蛋白质含量高和基质更为复杂的样品如肉类、动物肝脏等的应用还十分有限,共萃取物仍然具有脂肪和蛋白质等杂质含量高的缺点,会严重污染仪器,大大降低设备的灵敏度和使用寿命。液液萃取是一种最经典也是最成熟有效的提取方法,但是目前大多数都是采用单一溶剂多次提取或者极性相近的混合溶剂一步提取,采用极性相差较大的两种有机溶剂分两步提取在国内外仍然鲜有报道。本实验优化了采用极性较强的乙酸乙酯、乙腈作为第一步提取溶剂,极性较弱的丙酮、二氯甲烷作为第二步提取溶剂,分两步液液萃取磺胺的提取条件,并结合SPE净化猪肉样品,减少了基质效应,为采用HPLC-MS/MS测定动物源性食品中磺胺类药物提供更加成熟有效的检测手段。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 6410A高效液相色谱-串联质谱仪,配电喷雾离子源(ESI)(美国安捷伦科技有限公司); Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司); TGL20M湘立高速冷冻离心机(湖南湘立科学仪器有限公司); QF-3800氮气吹干仪(天津旗美科技有限公司); GX-274 ASPEC全自动固相萃取仪(美国吉尔森公司); DMT-2500多管旋涡混合仪(北京中兴伟业仪器有限公司); BUCHI GL45 Multivapor P-6浓缩蒸发仪(瑞士步琦公司); Oasis MCX固相萃取小柱, 60 mg, 3 mL(上海安谱有限公司)。

磺胺醋酰(sulfacetamide, SA)、磺胺嘧啶(sulfadiazine, SD)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SM1)、磺胺二甲嘧啶(sulfamerazine, SM2)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole, SMT2)、磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine, SCP)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine, SMM)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole, SMZ)、磺胺异恶唑(sulfisoxazole, SIZ)、磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine, SDM)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline, SQX),均购于美国Sigma公司,纯度≥99.6%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮,均为色谱纯(德国Merck公司);无水硫酸钠(用前需550 ℃灼烧6 h)、正己烷、正丙醇,均为分析纯(成都市科隆化学有限公司); C18粉末(50 μm, 6 nm)(上海安谱有限公司);超纯水(实验用一级水);实验用猪肉样品来源于监督抽样样品。

1.2 标准溶液的配制

精确称取11种磺胺类药物标准品各0.002 5 g,用乙腈溶解并定容至25 mL,配成质量浓度为100 mg/L的标准储备液(磺胺喹恶啉需要加入0.1%(v/v,下同)甲酸助溶),置于4 ℃冰箱中避光保存。再精密吸取各储备液于同一容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度,配成质量浓度为1 μg/L的混合标准中间工作液。

称取5份空白猪肉样品,按照既定的提取方法制备空白基质溶液,用混合标准中间工作液加不同体积的空白基质溶液配成20、50、100、200、400 μg/L系列标准工作液,现配现用。

1.3 样品前处理

1.3.1提取

准确称取5.00 g(精确到0.01 g)均质样品置于50 mL离心管中,加入5 g经灼烧的无水硫酸钠和6 g C18粉末,混合均匀,加入20 mL含2%甲酸的乙酸乙酯,涡旋振荡1 min,超声提取10 min, 8 000 r/min离心5 min,将有机层移入浓缩瓶中,残渣中再加入20 mL丙酮重复提取一次,合并转入浓缩瓶中,加入10 mL正丙醇,于旋转蒸发仪水浴45 ℃减压浓缩至近干,氮气流吹干,准确加入4 mL乙腈-水(1∶1, v/v)分两次洗涤浓缩瓶,将洗涤液转入氮吹管中,加入2 mL乙腈饱和过的正己烷溶液,涡旋振荡1 min,静置分层,弃去上层正己烷溶液,下层溶液待净化。

1.3.2净化

将MCX固相萃取小柱安装于全自动固相萃取仪中,先用3 mL甲醇和3 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液活化小柱,将提取液倒入小柱中,然后分别用2 mL 0.1 mol/L盐酸和2 mL水-甲醇-乙腈(55∶25∶20, v/v/v)洗涤小柱,用2 mL水-甲醇-乙腈-氨水(75∶10∶10∶5, v/v/v/v)洗脱药物,收集洗脱液于45 ℃水浴氮气吹干,用乙腈-水(1∶1, v/v)定容至1 mL,过0.22 μm微孔滤膜后,供LC-MS/MS分析。

1.4 分析条件

1.4.1色谱条件

色谱柱:Thermo Accucore C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱温:35 ℃;流速:0.3 mL/min;进样量:5 μL。流动相:A为0.1%(v/v,下同)甲酸水溶液,B为0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脱条件:0～3 min,B由10%升至20%; 3～8 min,B由20%升至35%; 8～11 min,B由35%升至95%; 11～13 min, B由95%降至10%,保持2 min;分析时间:23 min。

1.4.2质谱条件

电离方式:电喷雾离子(ESI)源,正离子模式;离子源温度:100 ℃;检测模式:多反应监测(MRM)模式;毛细管电压:4 000 V;脱溶剂温度:350 ℃;脱溶剂气流量:10 L/min;其余质谱参数见表1。

表 1 11种化合物的保留时间、监测离子对、毛细管出口电压及碰撞能量

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 两步液液萃取条件的优化

磺胺类属于酸碱两性化合物,不溶于非极性溶剂,但由于磺胺母体磺酰氨基的氮原子上含有两个H,碱性较强,在酸性水溶液中,磺胺类呈电离状态,溶解度也随之增大,因此在前处理过程中向提取液中加入适量甲酸以增加磺胺类化合物的溶解性,从而提高萃取效率。经实验发现,甲酸含量过低和过高都会导致磺胺的提取效率下降,一般添加量在1%～2%时回收率普遍较高,故本实验选择添加2%的甲酸。大部分研究仅采用单一溶剂或者混合溶剂一次提取,最常用的溶剂就是极性较强的乙腈、乙酸乙酯、水等。本实验研究了采用极性较强的乙酸乙酯、乙腈作为第一步萃取溶剂,极性较弱的二氯甲烷、丙酮作为第二步萃取溶剂,同时比较了单纯采用乙腈和乙酸乙酯作为萃取溶剂的提取效率,发现在第一步萃取剂选择上,乙酸乙酯比乙腈对磺胺类化合物的选择性要好,提取效率更高,同时,在第二步萃取溶剂选择上,发现丙酮能显著提高萃取效率,因此在乙酸乙酯提取后,再用等体积的丙酮提取,萃取效率提高了11.1%～66%,如图1所示。这可能是因为丙酮能有效破坏SAs中氨基与基质蛋白质的氢键作用。故选择先用乙酸乙酯溶液(含2%甲酸)萃取,再用丙酮溶液萃取。萃取溶剂的体积也会对提取效率产生不同程度的影响,本实验在萃取总体积40 mL不变的条件下,对乙酸乙酯和丙酮的添加体积(1∶1、1∶2、2∶1)进行优化,结果表明,乙酸乙酯和丙酮的添加体积为1∶1(即分别添加20 mL)时,11种磺胺类药物的回收率均在80%～120%之间(见图1),回收率高,提取效果好。说明丙酮的量显著影响磺胺与基质蛋白质相结合的氢键作用力。体积不足,导致不能完全破坏磺胺分子与基质蛋白质的结合氢键,体积过大,有可能会使更多基质蛋白质变性折叠,导致部分磺胺分子被蛋白质包埋。故本实验最终选择先用20 mL含2%甲酸的乙酸乙酯进行萃取,再用20 mL丙酮进行第二次萃取作为两步液液萃取的条件。

图 1 不同提取试剂、提取体积对磺胺类化合物回收率的影响Fig. 1 Effect of different extraction solvents and volumes on the recoveries of sulfonamides

2.2 仪器条件的优化

2.2.1色谱条件的优化

由于SAs在酸性条件下溶解性及稳定性较高,因此在流动相中加入甲酸;同时,甲酸有助于目标化合物在正离子模式条件下电离,提高目标物的响应值。试验以0.1%甲酸水溶液作为流动相的A相,考察了B相分别为0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇时,采用梯度洗脱程序对磺胺类药物的分离情况。结果表明:采用与定容溶液一致的甲酸乙腈溶液作为流动相的B相时,可以获得尖锐对称的峰形,同时响应值也更高。图2为0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇作为B相时50 μg/L标准溶液的总离子流色谱图(TIC)。采用乙腈时灵敏度比甲醇要高，峰形更好,故选择0.1%甲酸乙腈为流动相的B相。图3为50 μg/L标准溶液的MRM提取色谱图。

2.2.2质谱条件的优化

采用正离子模式对11种磺胺类化合物进行分析,分子离子峰均为[M-H]+形式。为提高目标化合物的离子化效率及灵敏度,对质谱各参数进行了优化。采用不接色谱柱直接进样,分别进行一级母离子扫描和二级子离子扫描,通过一级母离子扫描进一步确定各个化合物的母离子及去簇电压(fragmentor)值,通过二级子离子扫描进一步确定各个化合物至少两种响应值最高的子离子及每种子离子所需最佳的碰撞能(CE)。最后选定响应值最强、干扰最小的2个子离子作为定性离子和定量离子。通过对11种磺胺类化合物的二级子离子扫描发现,磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶的两个特征离子都一样,分别为m/z156、m/z108,可能因为所有磺胺类化合物母核均为对氨基苯磺酰胺,由于氨基的吸电子作用,使得苯环本身对磺酸基的吸电子能力减弱,导致磺酸基键在质谱碰撞能作用下容易断裂,得到两种比较固定的特征离子,这样只需对一两种磺胺类化合物的子离子CE进行优化,其他跟这些子离子一样的磺胺类化合物无需再进行单独优化,在此基础上进行微调即可,这样就大大缩短了子离子CE的优化时间。子离子的优化结果参数见表1。

图 2 两种B流动相条件下磺胺类药物的总离子流色谱图 (50 μg/L)Fig. 2 Total ion current chromatograms of sulfonamides with two B mobile phases (50 μg/L)

图 3 11种磺胺类药物的MRM提取离子色谱图(50 μg/L)Fig. 3 MRM extracted ion chromatograms of the 11 sulfonamide drugs (50 μg/L)

图 4 SPE净化对各目标化合物的基质抑制率的影响Fig. 4 Effect of SPE purification on matrix inhibition rate for the target compounds

2.2.3基质效应(ME)

磺胺类药物在质谱上的离子抑制效应很强,且基质对峰形干扰很大。本实验通过测定基质匹配标准溶液和纯溶剂标准溶液(50 μg/L)中各目标化合物的峰面积,采用两者峰面积差值的绝对值与纯溶剂标准溶液各目标化合物峰面积的比值来计算基质抑制率,从而评价基质效应[22]。比较了采用SPE小柱净化与不净化的基质抑制率,可以发现,经过SPE小柱净化后的样品基质抑制率要明显低于未经净化的(见图4)。SA在未经固相萃取小柱净化的情况下基质抑制率甚至高达60%,净化后降至30%左右,而SQX却基本不受基质效应的影响。目前降低基质效应的方法主要有制备基质匹配标准曲线、改进前处理技术、优化色谱条件以及控制流速等。所以,本实验通过改进前处理条件,以两步液液萃取结合固相萃取净化方式降低基质干扰,同时采用基质匹配标准溶液绘制标准曲线以尽量消除基质干扰带来的误差。

2.3 方法学验证

2.3.1线性范围、线性方程、检出限和定量限

精密吸取适量标准工作液用空白基质溶液分别配制成质量浓度为20、50、100、200、400 μg/L的标准工作系列,按本方法确定的条件分别进样分析,以目标化合物的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线。结果表明,在20～400 μg/L范围内,11种磺胺类药物均呈现良好的线性关系(相关系数(r2)≥0.99)。在阴性样品中加标测定,以S/N≥3对应的最低加标水平作为方法检出限,S/N≥10对应的最低加标水平作为定量限,结果见表2。

表 2 11种磺胺类药物的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.3.2加标回收率和精密度

本文对11种磺胺类兽药进行了3个添加水平的加标回收试验,每个添加水平做6次平行实验,计算11种磺胺类药物的3个不同水平的加标回收率及相对标准偏差(RSD),结果见表3。由表3可以看出,11种磺胺类兽药的平均加标回收率为79.3%～105.5%,相对标准偏差为1.3%～11.6%,满足兽药残留定性定量分析的要求。

2.4 实际样品分析

采用本方法对2018年度抽样的50批次鲜猪肉进行检测,其中2批次检出磺胺二甲基嘧啶,1批次检出磺胺间甲氧嘧啶,含量分别为28 μg/kg、55 μg/kg和78 μg/kg。阳性检出率为6%,虽然满足了农业部235号公告规定所有动物肌肉所含磺胺总量不得超过100 μg/kg的规定,但是也说明我国兽药滥用情况还是比较严重,人类长期食用还是会对身体健康造成一定的影响。

表 3 11种磺胺类药物在3个加标水平下的回收率及RSD (n=6)

3 结论

本文利用丙酮能有效破坏磺胺分子中氨基与基质蛋白质的氢键作用,建立了一种通过采用两种提取剂分两步液液萃取对猪肉基质中11种磺胺类药物的HPLC-MS/MS分析方法,克服了采用单一提取剂提取效率低的特点,同时结合固相萃取方法净化,进一步减少了目标物质中的杂质干扰,降低了基质效应和对仪器的影响,提高了检测的灵敏度,对改进猪肉中磺胺类兽药残留的液相色谱-串联质谱方法的前处理技术有较高的参考价值。