高效液相色谱-串联质谱法检测猪肉中3-甲基喹喔啉-2-羧酸残留

2019-09-16魏敏芝万建春张富生

色谱 2019年10期

魏敏芝, 万建春, 张富生, 潘华*

(1. 江西省农产品质量安全检测中心, 江西南昌 330012; 2. 江西省食品检验检测研究院, 江西南昌 330001)

喹乙醇是广谱抗菌药物,对革兰氏阳性和阴性菌都有抑制作用,尤其对猪痢疾疗效显著。我国农业部168号公告规定,不超过35 kg仔猪可以使用喹乙醇药物,用于促进其生长。动物喂食给药的喹乙醇大部分以原形药经尿液排泄到体外,此外其代谢产物还包括1-或4-单氮氧化物和3-甲基喹喔啉-2-羧酸(MQCA),其中MQCA被国际食品法典委员会认定为喹乙醇残留标志物。我国农业部公告235号规定猪肉中MQCA的限量值为4 μg/kg,欧盟和美国则禁止在动物养殖中使用喹乙醇。2018年我国农业部发布2638号公告,要求停止生产喹乙醇原料药及各种制剂;2019年5月1日起,喹乙醇被纳入动物养殖禁止使用的药物范围。

目前,动物源食品中MQCA残留量的前处理方式有酸解[1,2]和蛋白酶水解[3],其中酶解操作步骤繁琐,检测用时较长,而酸解处理的方式也更为便捷,且有文献报道[1,4]可以通过提高酸解温度缩短水解时间。动物源食品中MQCA残留量的检测方法主要有酶联免疫吸附法[5,6]、气相色谱-质谱法[7]、高效液相色谱法[1,8]和液相色谱-串联质谱法[9-14]。液相色谱-串联质谱法具有高选择性和高灵敏度的特点,适合食品中禁用药物残留量的测定。MQCA的相对分子质量较小,质谱检测易受干扰而影响定性判断,而通过更多的特征碎片离子信息匹配度的比较,可以提高方法的抗干扰能力。本文建立了液相色谱-串联质谱检测猪肉中MQCA残留量的方法,采用触发式多反应监测模式实现同时定量和确证,可为准确监控猪肉中MQCA的残留状况提供更可靠的检测技术。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1260-6470型液相色谱-串联质谱仪(配ESI源)、VAC ELUT-20固相萃取装置(美国Agilent公司); Vortex-Genie2涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司); SHA-B恒温水浴振荡器(常州智博瑞仪器制造有限公司)。

MQCA(纯度99.0%,德国Dr. Ehrenstorfer公司);盐酸、氯化钠(上海国药集团);氢氧化钠(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);氨水(质谱纯,上海安谱公司);乙酸乙酯、甲醇、乙腈(色谱纯,美国Honeywell公司);甲酸(色谱纯,美国Sigma公司)。强阴离子固相萃取小柱(MAX, 150 mg/6 mL,美国Waters公司);水为Milli-Q超纯水。

确证测试样品:猪肉样品由中国检验检疫科学研究院提供(编号17-D707), MQCA残留量为3.52 μg/kg。

1.2 样品前处理

称取匀浆后的猪肉试样2.0 g,置于50 mL聚丙烯离心管中,加入10 mL 0.3 mol/L盐酸溶液,于50 ℃水浴振荡提取30 min,依次加入5 mL乙腈、15 mL乙酸乙酯、2.5 g氯化钠,涡旋混合1 min,以8 000 r/min离心5 min,上层有机相全部转移至另一50 mL聚丙烯离心管中;加入5 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液,涡旋混合30 s,以8 000 r/min离心5 min。吸取下层全部水相层转入经5 mL甲醇、5 mL水活化的MAX小柱内,再分别用5 mL水、5 mL甲醇、5 mL乙酸乙酯淋洗,用空气吹干小柱内液体。用8 mL甲酸-乙酸乙酯(2∶98, v/v)溶液洗脱,收集全部洗脱液,于45 ℃下氮气吹干,用1 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈(5∶95, v/v)溶液溶解残渣,过0.22 μm尼龙滤膜,供LC-MS/MS测定。

1.3 标准溶液的配制

准确称取10 mg MQCA标准品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,配制1.0 g/L标准储备液,于-18 ℃下保存;用甲醇稀释标准储备液,制得MQCA标准中间液,临用现配。

基质匹配添加标准工作溶液:称取6份阴性猪肉试样,分别加入MQCA标准中间液,按1.2节处理,获得质量浓度为1、2、5、10、20、50 μg/L系列标准工作溶液。

1.4 分析条件

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm);柱温:35 ℃;流动相A：乙腈；流动相B：0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:0.3 mL/min。梯度洗脱条件:0～1.00 min, 5%A; 1.00～2.00 min, 5%A～40%A; 2.00～3.00 min, 40%A～90%A; 3.00～4.00 min, 90%A; 4.00～4.01 min, 90%A～5%A; 4.01～7.00 min, 5%A。进样体积:5 μL。

离子源:ESI源,正离子模式;扫描模式:动态多反应监测(dynamic MRM);毛细管电压:3 500 V;雾化气压力:310.2 kPa;鞘气温度:325 ℃;鞘气流量:12 mL/min;喷嘴电压:500 V;干燥气温度:200 ℃;干燥气流量:11 mL/min;碎裂电压:135 V。触发扫描阈值:100 cps;触发进入时间:2 ms;触发延迟时间:2 ms。MQCA的特征离子对和碰撞能量见表1。

表 1 MQCA的质谱参数

* Quantitative ion.

图 1 不同碰撞能量下MQCA的二级质谱图Fig. 1 MS/MS spectra of MQCA under different CEs

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

MQCA结构中有喹啉杂环,离子化时得到质子,形成[M+H]+母离子。在15、20和25 eV碰撞能量下分别碎裂母离子,获得不同碰撞能量下的二级子离子全扫描质谱图(见图1)。碰撞能量为15 eV时,得到m/z为145.1、143.2、117.8、91.9、76.9的碎片离子,此碰撞能量下仍可见m/z为189.0的母离子,但相对丰度很低。碰撞能量提高至20 eV时,m/z为145.1和143.2的碎片离子强度有所下降,子离子全扫质谱图中增加了m/z为127.9、102.1、65.0的特征峰,母离子的响应强度则与背景噪音水平相当。碰撞能量提高至25 eV时,没有新碎片离子增加,所有碎片离子的响应强度基本和碰撞能量20 eV下相当,由此确定MQCA的二级碎片离子的m/z为145.0、143.0、128.1、117.9、102.3、91.8、77.0和65.2。进一步优化各碎片离子的最佳碰撞能量,m/z为145.0和143.0两个特征离子的响应丰度最高,可作为多反应监测扫描离子,其中m/z为145.0的特征离子作为触发扫描离子。

2.2 色谱条件的优化

MQCA具有酸碱两性的特点,其在酸性环境条件下,表现出疏水性,反相色谱柱适合其分离。Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm×3.0 mm, 1.8 μm)的固定相粒径小,具有良好的保留性能,同时能缩短分析时间,适合酸性、碱性和中性化合物的分离。本文通过优化梯度洗脱条件,获得了MQCA尖锐、对称的色谱峰形和良好的色谱保留(见图2)。本文用获得的阴性猪肉基质提取测试液,配制基质标准溶液,对比了定容液配制的试剂标准溶液的分离效果(见图3)。结果表明,MQCA能够与基质背景中的大部分极性和弱极性干扰物分离,可以降低干扰物共流出对MQCA电离的影响。

图 2 MQCA标准溶液(5 μg/L)触发式多反应监测色谱图Fig. 2 Trigger MRM chromatograms of MQCA standard solution (5 μg/L)

图 3 阴性猪肉样品、基质标准溶液和试剂标准溶液(5 μg/L)的总离子流色谱图Fig. 3 TIC chromatograms of blank pork sample,matrix standard solution and reagent standard solution (5 μg/L)

2.3 样品前处理条件的优化

动物组织样品中MQCA残留量的检测多采用酶解[3,4]或酸水解[1,15]的前处理方式。酶解成本高,用时长,操作也繁杂;采用酸水解的方式,可以通过提高水解的温度,进而缩短水解时间。本文比较了2.0 mol/L和0.3 mol/L盐酸的水解效果,实验发现,采用0.3 mol/L盐酸水解提取后,提取液仍是酸性环境,这适合有机溶剂直接萃取目标物,而且提取效果也与采用2.0 mol/L盐酸时一致,因此确定水解提取的盐酸浓度为0.3 mol/L。

实验比较了不同萃取试剂的萃取效果,分别采用正己烷、乙酸乙酯、乙腈-乙酸乙酯(1∶3, v/v)3种溶剂。采用正己烷萃取,萃取效率最低,且样液乳化严重,高速离心后仍有一定乳化现象;采用乙酸乙酯萃取,乳化情况稍好;采用乙腈和乙酸乙酯混合体系萃取时,萃取效率最高,且试样液中加入乙腈,可以沉淀试样液中的蛋白质,再加入乙酸萃取,能明显改善样液的乳化现象。

MQCA在碱性条件可用阴离子交换固相萃取柱净化[16]。萃取液中加入氢氧化钠溶液,MQCA呈阴离子态,可被MAX小柱吸附。实验依次用水、甲醇、乙酸乙酯淋洗小柱,以除去极性和非极性杂质,最后用酸化乙酸乙酯洗脱目标物。本文对洗脱溶液体积进行了优化,将含5.0、10.0和50.0 μg/kg 3个水平的上样液分别加入小柱,经淋洗后,用酸化乙酯乙酯分多次洗脱小柱,每次用2 mL洗脱液,分别测试每次洗脱液中MQCA的含量,发现第4次洗脱小柱后,只有50.0 μg/kg水平试验的洗脱液中有少量目标物检出。当洗脱液增加到10 mL时,3个水平下的收集液中均未检出目标物。因此最终本文确定洗脱体积为8 mL。

2.4 定量测定

用阴性猪肉样品进行加标实验,以目标物信噪比(S/N)的3倍和10倍水平分别确定检出限和定量限,分别为0.15 μg/kg和0.5 μg/kg。

用阴性猪肉样品按前述方法制备获得的空白基质溶液,对比相同浓度的基质标准溶液与试剂标准溶液的响应值,发现样品净化后有基质增强效应,因此本文确定用基质匹配添加标准曲线定量。在1.0～50 μg/L范围内,MQCA呈线性相关,相关系数(R2)为0.999 7。在0.5、1.0、5.0 μg/kg3个水平下进行加标回收试验,MQCA的回收率为90.5%～119.6%,相对标准偏差为3.14%～4.22%(见表2)。

表 2 猪肉中MQCA的加标回收率(n=6)

图 4 MQCA确证测试样品质谱图与参考标准品质谱图对比Fig. 4 Comparison of mass spectra of the MQCA confirmed test sample with reference standard sample

2.5 确证实验

定性离子丰度比或特征离子匹配度是质谱确证的主要方式,多反应监测的选择性很高,但仍存在基质干扰导致假阳性的风险,尤其是小分子化合物的检测。为提高确证结果的可靠性,选择数量更多特征碎片离子的定性判断会更可靠,但若连续监测全部离子对,会降低质谱循环扫描时间,影响定量结果数据点的获取。触发式多反应监测不仅能满足定量分析的要求,而且可以通过触发的二次扫描,获得化合物确证的质谱谱库[17],通过比对样品谱图与标准品谱图,实现确证样品中的待测物。实验采用中国检验检疫科学研究院提供的猪肉样品进行确证实验,测得样品中MQCA含量为3.46 μg/kg,同时也获得触发式MRM的质谱图。将该图与标准品谱图比对(见图4),表明测试样品所获特征离子与标准谱图全部匹配。通过阳性样品的验证测试,表明本方法可实现准确定量和确证。