三种赣产葛地上部分总黄酮提取工艺优化及含量测定*

曾慧婷 李晶 陈超 何小群 陈星星 虞金宝 王小青

（江西省中医药研究院 南昌330046）

葛为豆科（Leguminosae）葛属（Pueraria）多年生落叶藤本植物，始载于汉代《神农本草经》：“主消渴，身大热、呕吐、诸痹，起阴气，解诸毒，味甘、辛、凉，归脾胃二经”，列为上品[1]。在我国，葛属植物约有11种，其中野葛和粉葛为我国资源较多、分布最广、产量最高的葛属植物，粉葛多为栽培，安徽、江西、浙江、四川、湖北、云南及湖南等地都有野生葛分布[2～3]。江西种葛、食葛历史悠久，上饶市横峰县葛资源丰富、品种优良，享有“中国葛之乡”的美誉[4]。现代研究表明，葛根有效成分主要有葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物，在治疗心血管疾病、降血糖、抗肿瘤、抗菌抗病毒等方面表现出显著的药理活性[5～6]。此外，葛根尚含有丰富的葛根淀粉、蛋白质、人体所需的多种氨基酸和微量元素等，具有良好的食用价值，素有“北参南葛、亚洲人参”之称，粉葛于2018 年新增入药食同源目录[7～8]。随着葛根在医药和食品领域的需求量不断增加以及中药材产业扶贫行动计划的贯彻落实，多地正引导贫困地区建立基地，发展大宗药材和道地药材的种植，促进贫困户脱贫增收[9]。目前，江西各地已有一定规模的葛种植基地，然而对葛资源的利用仍然以其传统药用部位根部入药或制作葛粉为主，葛花亦有见于解酒保肝之用，其地上部分的茎和叶在葛根采收过程中往往被废弃，造成了资源的巨大浪费和生态环境的污染。明朝李时珍认为，葛的根、茎、叶、花和果均可入药；现代研究亦证实，葛的茎、叶和花中尚含有丰富的异黄酮类化学成分，若加以利用，将产生可观的经济效益[10]。本研究基于中药资源化学研究思路，对我院中药资源普查工作中所收集的三种赣产葛根及其地上部分的总黄酮含量进行了测定，并对葛地上部分中总黄酮类化合物的提取工艺进行了优化，以期为葛地上部分资源的深入研究和开发利用提供参考依据。现报道如下：

1 材料与仪器

1.1 试剂与药材 葛根素（批号1110752-201615，购于中国食品药品检定研究院）。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。药材信息：三种赣产葛根类及其地上部分样品10 批，均为本课题组开展中药资源普查过程中所收集，均经江西省中医药研究院虞金宝研究员鉴定。样品1～4 为2017 年9 月在资溪县马头山国家级自然保护区采集的野葛P.lobata（Willd.）Ohwi 的根、茎、叶和花；样品5～7 为2018年8 月由江西绿色生态葛研究所（横峰县莲荷乡）提供的一年生赣葛2 号（粉葛P.thomsonii Benth.）根、茎和叶；样品8～10 为2018 年8 月在黎川县德胜镇采集的野葛P.lobata（Willd.）Ohwi 根、茎和叶，60℃烘干至恒重，粉碎过4 号筛，干燥保存。见表1。

表1 样品信息

1.2 仪器与设备 SimplicityTM个人型超纯水系统（德国默克密理博公司）；CQ-250 超声波清洗器（上海船舶电子设备研究所）；AG-135 电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SHIMADZU UV-2450 紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；高速中药粉碎机YF-1000（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）。

2 方法与结果

2.1 葛不同部位总黄酮的含量测定

2.1.1 供试品溶液制备 精密称取编号1～10 样品粉末（过4 号筛）各1 g，置于100 ml 具塞锥形瓶中，精密加入40 ml 80%乙醇，精密称重，90℃回流1 h，放冷，补足失重，过滤合并滤液，精密量取续滤液1 ml，置于50 ml 棕色量瓶中，加水至刻度并摇匀，即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取葛根素对照品5.95 mg，置于10 ml 棕色容量瓶中，加80%乙醇适量，超声使其溶解后放冷，加80%乙醇至刻度并摇匀。精密量取2 ml，置于10 ml 棕色容量瓶中，加80%乙醇至刻度并摇匀，即得浓度为119 μg/ml 的对照品储备液。

2.1.3 检测波长的选择 精密吸取葛根素对照品储备液1 ml 置10 ml 容量瓶中，加80%乙醇溶液至刻度，摇匀，静置30 min 后，用紫外-可见分光光度计在200～500 nm 范围内扫描，250 nm 波长下有最大吸收。见图1。

图1 对照品扫描图谱

2.1.4 方法学考察 （1）线性关系考察：精密量取葛根素对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml 分别置于10 ml 容量瓶中，并用80%乙醇稀释至刻度，摇匀。以80%乙醇作空白参照，在250 nm 处测定其吸光度。以浓度为自变量X，吸光度为因变量Y 绘制标准曲线，所得回归方程为：Y=0.065 9X-0.005 6（R2=0.999 8）。结果表明，葛根素在0.0～11.9 μg/ml范围内，线性关系良好。（2）精密度试验：精密量取6号样品溶液6 份，分别按（1）项下方法，于250 nm处测定吸光度，重复6 次，RSD 为0.22%，表明该法的精密度良好。（3）稳定性试验：将6 号供试品溶液分别冷藏避光放置0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，按照（1）项下操作，测定吸光度。RSD 为1.28%，结果表明供试品溶液冷藏避光放置5 d 对测定结果无影响。（4）重复性试验：取6 号供试品粉末1 g 共6 份，照“2.1.1”项下方法处理后，测定吸光度，RSD 为0.42%，表明该法重复性良好。（5）加样回收率试验：称取6 号供试品粉末0.5 g 共6 份，每份精密加入相当于0.5 g 该供试品粉末中葛根素含量的对照品溶液，再按照“2.1.1”项下方法处理后，测定吸光度，计算平均回收率为99.96%，RSD 为0.89%。

2.1.5 总黄酮含量测定 将所得供试品溶液用80%乙醇溶液稀释，其中根和茎供试品溶液稀释100 倍，叶供试品溶液稀释50 倍，花供试品溶液稀释200 倍，摇匀，静置10 min 后在250 nm 波长处测定吸光度。根据标准曲线，计算出总黄酮的百分含量后进行比较。总黄酮含量最高的为黎川县所采集的野葛根，其次为资溪县所采集的葛花，葛叶中总黄酮含量稍高于葛茎，地上茎叶黄酮含量较高的是横峰县赣葛2 号品种。见表2。

表2 葛不同部位总黄酮含量测定结果

2.2 葛地上部分总黄酮提取工艺参数优化

2.2.1 正交试验设计 基于前期单因素试验结果，以乙醇浓度（A）、料液比（B）、回流提取时间（C）为主要考察因素，以葛地上部分（6 号样品）中总黄酮提取率为考察指标，通过L9（34）正交试验优化葛地上部分中总黄酮的最佳提取工艺参数。正交试验因素水平表见表3。

表3 L9（34）正交试验因素水平表

2.2.2 正交试验结果 有表中极差R 值可知，影响葛地上部分总黄酮提取的因素主次顺序为A＞B＞C，即提取所需乙醇浓度影响最大，其次为提取的料液比，最后为回流提取时间，葛地上部分总黄酮提取最佳组合工艺为A1B3C2，即提取乙醇浓度为60%、料液比为1:50、回流提取时间为1.5 h 时，葛地上部分茎中总黄酮提取量最高。见表4。

表4 葛地上部分总黄酮提取条件优化正交试验结果

3 结论

葛根中主要的化学成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷等异黄酮类化合物，文献报道和前期研究表明，葛地上部分中含有与葛根类似的化学成分，关于其总黄酮测定的报道较多，主要有高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法等。紫外-可见分光光度法以NaNO2-Al（NO）3显色法最为常用，通过对该法的专属性考察，发现碱性环境、样品成分复杂等因素均会影响实验的准确性，具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在510 nm 波长下也会有最大吸收，葛中异黄酮类化合物不具备邻二酚羟基结构，我们前期预试亦证实采用NaNO2-Al（NO）3显色法测定葛不同部位总黄酮的含量，对结果准确度干扰较大。本研究以葛根素为对照品，采用直接测定法在最大吸收波长250 nm 下测定了三种赣产葛不同部位的总黄酮含量，方法学考察符合含量测定要求，且相较于显色法，操作更简便和节省试剂。

近年来，关于葛地上部分的研究报道逐渐增多，本研究以中药资源普查工作中所收集的2 种野葛和1 种粉葛作为研究对象，结果表明，总黄酮以黎川县所采的野葛根含量最高，可达7.61%，地上部分茎和叶总黄酮含量则是横峰县所产的赣葛2 号较高。我们以葛茎为原料，采用正交设计对乙醇浓度、料液比和回流提取时间等提取工艺条件进行优化，得到最佳提取工艺为乙醇浓度60%、料液比1:50、回流1.5 h。K1（6.807）、K2（6.905）分别是提取时间为1 h、1.5 h的均值，极差R=0.098 亦表明提取时间对结果无显著性影响，因此，为节省时间将提取时间改为回流提取1 h。

本研究比较了3 种赣产葛根及其地上部分总黄酮含量，但所收集的药材品种数较少，不足以说明野葛与粉葛不同部位总黄酮含量的差异，但可初步揭示横峰所产赣葛2 号地上部分黄酮类成分相对较高，也说明葛采收加工过程废弃的地上部分具有潜在的利用价值。优化葛地上部分黄酮类成分的最佳提取工艺，可为葛资源的深入研究与开发利用提供理论基础，延伸其资源经济产业链，使葛资源利用进一步综合化、合理化。