辣椒酱发酵过程中蛋白酶活性变化的研究

洪 玲

(新田县市场监督检验检测中心，湖南 永州 425700)

辣椒自明朝时传入中国后就开始在华夏的土地上广泛种植，后成为菜品中必备的一种蔬菜，从古代一直流传至今，而目前辣椒的种植已经遍布全世界，成为各国人民佐餐必不可少的一种重要原料。辣椒中含有辣椒碱，其包括多种不同结构的化学物质如辣椒素、降二氢辣椒碱等[1]，王梦等[2]将几种辣椒素单同维生素E做对比，发现辣椒碱单位物质都具有明显的抗氧化性，但这类物质虽会刺激口腔和皮肤让人产生痛觉，但可以增进食欲，促进人体血液循环，更新细胞，使皮肤保持年轻状态，改善寒凉体质。同时富含维生素，尤其是VC含量，平均约为180 mg/100 g以上[3]，红辣椒中还含有辣椒红色素[4]，这是一种混合物主要成分是叶黄素中的不同分子成分，可以作为食品的着色剂，颜色亮丽、无毒无害，还具有抗氧化的特性。

辣椒的加工目前应用最多的是初级加工，如制成干辣椒；既能长期储存又能用于调味，谌智鑫等考察了不同储藏环境对干辣椒品质的影响；制成油辣椒；贵州省知名品牌的老干妈就是将辣椒进行油炸后制成的调味品，张学君等发明了一种油辣椒的制作方法，具有香辣口感、保质期长和营养丰富等特点。而要想获得高附加值的产品还要对辣椒进行深加工，比如提取辣椒碱、辣椒素，有研究学者发现经过稀释的辣椒素具有美白皮肤的作用，可以制成化妆品使用[5-10]。而目前应用最广泛的是将辣椒制成辣椒酱[11]， 用油脂煎炸辣椒，待五分熟后，加入黄豆酱制成简单的家庭食用的熟酱，既具有典型的豆酱香味又有辣椒的味道和口感。而目前辣椒酱的制作已经发展到加入多种香辛料如生姜、大蒜、花椒甚至西红柿等[12]，以及加入糖、食盐、黄酒等，由微生物发酵制成调味品，相似的产品还有糟辣椒[13]，辣椒酱不仅营养丰富，通过微生物发酵的方式制成的风味发酵制品更具有市场前景。本实验以辣椒酱工艺为研究对象，考察并分析了辣酱制作过程中蛋白酶活性值的变化趋势，找出发酵型辣椒酱适宜的发酵温度、发酵时间。

1 实验原理

1.1 酶活测定实验原理

分光光度法是酶活力研究常用的方法，酶促反应中的底物常含有光谱紫区光学吸收的不饱和自由基。反应底物的浓度以在特定波长的吸收量来测量，而酶反应的进展则根据光吸收的变化来测量。本实验主要利用该原理测定辣椒酱发酵过程中的蛋白酶活性，如梅源等通过测定不同菌种接种霉豆瓣后考察在发酵过程中的优势菌种以及蛋白酶活性，提高酱醪质量，确定最佳发酵菌种以及生产工艺[14]。

1.2 DGGE鉴定微生物群落原理

DGGE(变性梯度凝胶电泳)是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种可以确定发酵产品如酒醅、醋醅、酱醪基质发酵过程中微生物群落演替的一种分子标记方法。现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。DGGE/TGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性[15，16]。

1.3 辣椒酱制作过程

挑选一定数量的大豆，除去可见的颗粒物，挑选饱满、无腐烂和破损的颗粒。用清水冲洗，然后用清水浸泡，浸泡时间约为24 h，确保豆皮出现褶皱。将浸泡过的大豆滤出水分，放入蒸煮锅中，直到几乎变软为止。根据配方要求蒸好的大豆将和蒸好的面粉混合后接入种曲，送入曲房。原料混合均匀，接种均匀，接种量0.3%，确保曲料疏松均匀地播撒，厚薄均匀。入曲后马上进行翻曲，然后将面粉均匀地撒在纱布上，使其自然发酵，直到菌丝变成黄绿色。挑大小合适的辣椒，要求成熟、不腐烂。清洗，从中间切成两半，用勺子把肉挖出来，切成约2 cm的小块，放入托盘中供日后使用。最后，用天平称重225 g的小辣椒、45 g的豆腐、10 g的生姜，并将适量的辣椒和八角混合。将混合好的原料放入罐中，在实验要求的条件下发酵,实验流程见图1。

图1 辣椒酱工艺流程图Fig.1 Process flow chart of chili sauce

2 材料与方法

2.1 实验材料

丙烯酰胺/甲叉(37.5∶1)、尿素、100%去离子甲酰胺、50×TAE缓冲液、10 mg/mL溴化乙锭、2×胶上样染料、过硫酸铵、TEMED：上海生工集团有限公司；酪蛋白：美国Sigma公司。

2.2 实验方法

将0.3 g琼脂糖溶解于30 mL的1×TAE缓冲溶液中，加热溶解(微波炉加热或沸水浴加热，至琼脂糖溶解)，稍微降温后加入3 μL的核酸染料，混匀后倒入托盘中，插入梳子，约0.5 h后其冷却。将凝胶放入电解槽中，加样(加有loading buffer的DNA样品)，在5 V/cm电压下电泳30 min。在紫外光下观察电泳条带。

反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，65 ℃复性45 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；72 ℃最终延伸5 min。将不同发酵过程的酱醪在容器不同部分取10份，使用DNA提取试剂盒进行提取，PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下用无菌刀割下含目的DNA片段的琼脂糖块，称重，放入1.5 mL的离心管中，用DNA纯化通用试剂盒纯化PCR产物，并用紫外分光光度计测定DNA浓度。反应体系见表1。

表1 25 mL PCR 反应体系Table 1 25 mL PCR reaction system

2.3 标准曲线的绘制

准确称重1 g蛋白酶，用少量磷酸盐缓冲液溶解后用玻璃棒研磨，然后将上液倒入100 mL的容量瓶中，再用玻璃棒在沉积物中加入少量缓冲，最后全部转移到容量瓶中，稀释到指定的比例，用4层纱布过滤。该酶已稀释100倍，滤液可直接用作试验酶。根据表2准备l-酪氨酸标准溶液。

表2 氨基酸标准溶液比率表Table 2 Standard solution ratio table of amino acid

2.4 样品测定

取上述每个溶液1.00 mL，在每个溶液中加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00 mL，不同浓度试剂溶液1.00 mL，放入(40±0.2) ℃恒温水浴2 min，然后在波长680 nm用分光光度计测OD值，比色法去除，以无酪氨酸零管作为空白管，分别调整零点，测吸收度值，以吸收度值作为纵坐标，酪氨酸浓度作为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。在OD为1时计算酪氨酸的量(μg)，即吸光度常数k值，其k值应在95～100之间。将2%的酪蛋白溶液置于(40±0.2) ℃的恒温水浴中，预热5 min；取4管，加入1 mL的酶解液,取1根作为空白管，加入2 mL的三氯乙酸溶液，在其他3个试管中各加入3 mL的酪蛋白溶液，摇匀，保持在40 ℃，持续10 min；取出试管，在3个试管中各加入2 mL的三氯乙酸溶液，在空白试管中加入1 mL的酪蛋白溶液，静止10 min后，沉淀落到试管底部，从每个管中取出1 mL的滤液，分别加入5 mL的Na2CO3溶液和1 mL的福林试剂溶液。颜色是在40 ℃的恒温水浴中培养20 min后形成的，OD值在680 nm波长下测量，用空管调整零点，使用Excel软件绘制标准曲线，见图2。

图2 标准曲线图Fig.2 Standard curve diagram

3 分析与讨论

表3 短期内不同培养温度和培养时间的蛋白酶活力变化值Table 3 Changes of protease activity at different culture temperatures and culture time in a short term

图3 短期内辣椒酱发酵过程蛋白酶活力变化图Fig.3 Change chart of protease activity in chili sauce fermentation in a short term

由表3和图3可知，在辣椒酱制作过程中，在同一发酵日内，第1天在3种不同温度下测得的豆腐的蛋白酶活性值不高，而第2天的蛋白酶活性含量变化的速率增加，第3天在3个温度下测得的蛋白酶活性持续上升，达到了活动的峰值和最高值。其中蛋白酶活性值最高为35 ℃，其次为40 ℃，在室温下蛋白酶活性值最低为30 ℃。第4天活动值下降，但变化不明显。第5天开始急剧下降，蛋白酶活力最低。在相同的温度条件下(30，35，40 ℃)，第1～3天，蛋白酶活力变化呈直线上升的趋势，第3天达到高峰，这是蛋白酶的最高值。第4天呈下降趋势，第5天的变化值趋于稳定。

表4 长时间培养条件下不同培养温度和培养时间的蛋白酶活力变化值Table 4 Changes of protease activity at different culture temperatures and culture time under long-termculture condition

图4 长时间培养条件下不同培养温度和培养时间的蛋白酶活力变化图Fig.4 Change chart of protease activity at different culturetemperatures and culture time under long-termculture condition

由表4和图4可知，在同一发酵日内，第1天在3种不同温度下测得的辣椒酱酱醪中的蛋白酶活性值不大，并且在第5天蛋白酶活性值的变化率加速，在3个温度下测得的蛋白酶活性值继续呈线性上升，并在第20天达到峰值，活性值最高。其中蛋白酶活性值最高为40 ℃，其次为35 ℃，在室温下蛋白酶活性值最低为30 ℃。在第25天，活动值下降，但变化不明显。在第30天，活动值开始持平。在相同温度条件下(30，35，40 ℃)，从第1～12天，基本上呈稳定上升趋势，在第20天达到最高值，蛋白酶活性值最高。25天的变化值略有下降，30天的变化值趋于持平。

不同发酵时间辣椒酱醪的DGGE图谱见图5。

图5 不同发酵时间辣椒酱醪DGGE电泳图Fig.5 DGGE electrophorograms of chili sauce mashat different fermentation time

图5中A为前5 d辣椒酱酱醪中微生物群落分布，可以看出变化基本不大，微生物群落以及生物量基本一致。图5中B为10～40 d发酵过程中微生物群落变化图，其中第10天微生物构成最为丰富，15～30 d之间微生物群落变化较小，从第35天开始微生物群落变化很小。连同蛋白酶的变化数据可以看出，后期产蛋白酶的真菌逐渐被乳酸菌等多种不同种类细菌逐渐取代。周雯君等[17]通过测定酱油曲中的中性蛋白酶活性进行跟踪，可以根据其数据判定豆酱是否成熟以及在不同发酵阶段的典型微生物群落构成。梁晋维等[18]通过单因素实验考察了筛选得到的米曲霉AspergillusoryzaeNCFEC03产蛋白酶的最优条件，因为豆酱起始必须有足够的蛋白酶降解蛋白质才能得到高品质的成品酱。童佳[19]通过实验测定了米曲霉产蛋白酶的规律支持了这种结果。樊君等[20]通过实验测定圆盘制曲过程中蛋白酶活力值的最优条件，以期能够正确、有效地指导实际生产。朱永清等[21]使用DGGE技术分析了不同豆酱样品中微生物真菌菌群结构,以期获得高品质豆酱同微生物群落之间的关系。高秀芝等[22]使用DGGE方法测定了东北传统发酵豆酱中微生物群落的动态变化，确定了不同发酵时间微生物群落变化，其研究结果与本实验研究结果相似。

4 讨论

在不同的温度条件和发酵天数下，测定了辣椒酱中蛋白酶在发酵过程中不同时间内的活性变化值。在辣椒酱制作过程中，蛋白酶的活性值在相同温度条件下第3天最高，35 ℃的蛋白酶活性值在相同发酵日内最高。可见在制作辣椒酱的过程中，适宜的发酵温度为35 ℃，适宜的发酵天数为3 d。在制作酱料的过程中，在同一温度条件下，蛋白酶活性在第20天最高；在同一发酵日内，辣椒酱的蛋白酶活性最高；可见在制作辣椒酱的过程中，适宜的发酵温度为40 ℃，适宜的发酵天数为20 d。