水豆豉中高产豆豉纤溶酶的菌株筛选、鉴定及生长性能研究

董科，陈宇航，沈丹芸，裴晓方*

(1.四川大学 华西公共卫生学院(华西第四医院)，成都 610041；2.食品安全监测与风险评估四川省重点实验室，成都 610041)

豆豉纤溶酶(douchi fibrinolytic enzyme，DFE)是我国学者从传统发酵食品豆豉中分离得到的一种丝氨酸蛋白酶。有研究表明，该酶是一种新型纤溶酶[1]，不仅具有半衰期长、纤溶活性高、安全无毒、口服效率高等优点[2,3]，还可弥补目前临床上治疗血栓性疾病使用的溶栓剂如尿激酶和链激酶半衰期短、成本高、效率低等不足[4]。因此，通过各种微生物来源的纤溶酶治疗血栓新型药物的研究开发受到世界各国学者的重视。

1987年，日本学者发现了大豆发酵食品纳豆中的纳豆激酶具有高纤溶活性[5]，后续研究更揭示了纳豆激酶具有降血压、抗动脉粥样硬化、抗凝、神经保护等作用[6]，且相关保健品已在市面上进行销售；1996年，韩国学者[7]从本国传统发酵食品Chung Kook-Jang中分离得到具有高活性的纤溶酶。而我国学者[8]也早在1999年就从豆豉中分离到了豆豉纤溶酶，并对其进行了大量的研究工作，包括产酶菌株的筛选、产酶基因克隆、豆豉纤溶酶的分离与纯化及溶血栓机制的研究等[9]。但是，目前分离得到的豆豉纤溶酶酶活力低下和生产力水平不足制约着其进一步开发成为溶栓药物。因此，通过豆豉纤溶酶高产菌株的筛选等方式提高酶活力及产量成为突破现有研究瓶颈的关键。

本研究以市售水豆豉为原材料，采用平板法初筛和化学法复筛相结合的方法，旨在筛选出1株活性较高的豆豉纤溶酶产酶菌株，为将水豆豉及相关发酵产品研发成具有溶栓作用的健康产品提供了备选菌株及理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

在四川、云南和贵州省收集11种水豆豉样品，收集后的样品立即进行细菌分离培养，并将剩余样品存于灭菌均质袋中，-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂

营养琼脂培养基、酪蛋白培养基和LB肉汤培养基：均购于北京路桥技术有限责任公司；福林酚：购于北京索莱宝科技有限公司；酪蛋白：购于中国食品药品检定研究所；纤维蛋白原和凝血酶：购自Sigma公司；尿激酶：购自Aladdin公司；可溶性淀粉、无水碳酸钠、L-酪氨酸、柠檬酸等其他试剂：均为国产分析纯。

1.3 仪器与设备

隔水式恒温培养箱 上海飞跃实验仪器有限公司；Multiskan GO酶标仪 赛默飞世尔科技公司；5430R低温高速离心机 德国Eppendorf公司；HR40-Ⅱ A2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司；分子成像仪、Power Pac BasicTM电泳仪、C1000 TouchTMThermal Cycler PCR扩增仪 BIO-RAD公司。

1.4 实验方法

1.4.1 菌株分离

将获得的水豆豉样品在无菌条件下各取3 g并加入营养肉汤，37 ℃、150 r/min摇床增菌培养24 h后，在营养琼脂平板上划线分离，于37 ℃恒温培养箱培养24 h，从平板中挑取形态、颜色不同(即可能为不同菌种)的菌落于斜面培养基(营养琼脂)上保存，备用。

1.4.2 菌株产酶能力初筛

蛋白酶、淀粉酶初筛：将复苏24 h后的菌株点种于酪蛋白培养基和淀粉培养基上(淀粉酶初筛需要在菌落周围滴加0.02 mol/L碘液)，观察形成的透明圈，记录透明圈直径与菌落直径，取透明圈直径/菌落直径进行比较。

豆豉纤溶酶初筛：接种菌株至肉汤，培养24 h，离心后吸取上清液8 μL滴加至纤维蛋白平板孔内。37 ℃恒温培养箱孵育，16 h后测量垂直透明圈直径。根据尿激酶标准曲线得到菌株于肉汤中所产的豆豉纤溶酶含量。

1.4.3 菌株产酶能力复筛

选取初筛后产酶能力较强的菌株，根据相关标准[10]中蛋白酶、淀粉酶的检测方法及文献[11]所述纤维蛋白酶解法进行复筛。

1.4.4 菌株常规鉴定

根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)和《常用细菌鉴定手册》(2001年)等所提及的方法对筛选出的高产纤溶酶菌株进行生理生化特性鉴定。

1.4.5 细菌gyrB基因测序鉴定及系统发育分析

用直接水煮法提取细菌DNA，进行PCR扩增。细菌gyrB基因引物序列：UP2r：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′；UP1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAA

RTTYGA-3′， 扩增片段长度为1200 bp。扩增体系为(25 μL)：2×Mix(包含dNTP、Mg2+、Reaction Buffer、Polymerase)为12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)为1.0 μL，ddH2O为8.5 μL，DNA模板为2 μL。扩增条件：98 ℃预变性2 min；(98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s)35个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定后送测序。测序结果经Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行核酸序列相似度比较，并使用Mega 6.0作系统进化树，选取遗传距离最近的种进行鉴定。

1.4.6 细菌生长性能测定

将已鉴定的菌株复苏后每2 h吸取一定量菌液，用酶标仪在600 nm下检测其OD值，至28 h结束，绘制菌株的生长曲线；另每2 h吸取一定量菌液离心后取其上清液，过0.22 μm滤膜后检测豆豉纤溶酶含量，至28 h结束，绘制菌株的产酶曲线。

2 结果与分析

2.1 菌株产酶能力的初筛

2.1.1 蛋白酶、淀粉酶初筛结果

从11份水豆豉样品中分离出79株细菌(B01～B79)。以透明圈直径/菌落直径为考察蛋白酶(4 d)、淀粉酶(2 d)能力的指标。79株细菌的测定结果见表1，可见蛋白酶产酶率(98.7%)高于淀粉酶产酶率(83.5%)，且不同菌株产淀粉酶的能力较接近。其中，两株细菌的产蛋白酶能力最高，其4 d透明圈直径/菌落直径为7(B29、B49)，仅有1株菌不产蛋白酶或产酶较少(B10)，无透明圈产生。

表1 细菌产蛋白酶、淀粉酶能力初筛结果Table 1 Preliminary screening results of protease and amylase production ability of bacteria

酪蛋白平板的检测图见图1中a，b，除图1中b左下角的大肠杆菌标准株外，其余7株细菌均能产不同程度的蛋白酶。淀粉培养基的检测图见图1中c,d，除图1中c左边两株菌及图1中d右上角菌株外，其余菌株均产淀粉酶。

图1 平板法产酶能力初筛Fig.1 Preliminary screening of enzyme production ability by plate method

注：a,b为酪蛋白平板；c,d为淀粉培养基；e,f为纤维蛋白平板。

2.1.2 豆豉纤溶酶初筛结果

79株细菌产豆豉纤溶酶的测定结果见表2，产酶率为98.7%，不同菌株产酶能力差异较大。其中有29株细菌豆豉纤溶酶活性低于200 IU/mL，3株豆豉纤溶酶活性高于4000 IU/mL(B03、B61、B62)，活性最高的为6728 IU/mL(B03)，B10号菌株依然无透明圈产生。

表2 细菌产豆豉纤溶酶能力初筛结果Table 2 Preliminary screening results of douchi fibrinolytic enzyme production ability of bacteria

纤维蛋白平板的检测图见图1中e,f。e为尿激酶标准溶液的溶解圈，f中除10号孔外，其余孔均有不同程度的豆豉纤溶酶产生。

2.2 菌株产酶能力的复筛结果

2.2.1 菌株选取

从初筛结果中选取同时满足酪蛋白平板4 d透明圈与菌株直径比≥3，淀粉培养基透明圈与菌株直径比≥1，豆豉纤溶酶活力≥1000 IU/mL的菌株进行产酶能力的复筛。共有6株细菌满足要求，分别是B02、B17、B37、B61、B62、B70。

2.2.2 菌株产酶能力复筛结果

菌株使用化学法复筛的结果见表3。除了B02与B37产碱性蛋白酶外，其余为中性蛋白酶。活性最高的前3个菌株分别为B02、B62、B61。产淀粉酶活性最高的菌株分别为B61、B17、B62。产豆豉纤溶酶能力最高的分别是B61、B70、B02。故综合菌株3种产酶能力的情况，选择B61号菌株进行斜面保存，并进行菌种鉴定。

表3 细菌产酶能力复筛Table 3 Rescreening of enzyme production ability of bacteria

注：由于菌株产淀粉酶含量过低，附录中并不能查到相应的酶浓度，故在此以试验孔与阴性对照孔的吸光度差值表示。差值越大，代表酶浓度越高。

2.3 B61菌株的鉴定

2.3.1 菌株形态学鉴定

B61接种营养琼脂，37 ℃培养24 h后，菌落大小约为0.8 μm×1.2 μm，颜色呈乳白色不透明，形状最初为圆形，继而边缘开始褶皱不整齐，挑开菌落后有粘液状分泌物。显微镜下单个菌体呈杆状，革兰染色反应呈阳性，结果见图2。

图2 B61形态学鉴定Fig.2 Morphological identification of strain B61

注：a为菌落形态；b为显微镜下革兰染色图(×1000)。

2.3.2 菌株生化反应鉴定

将B61菌株与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌标准菌及贝莱斯芽孢杆菌对照，包括形态、生理、生化，结果见表4。同时根据《伯杰氏细菌鉴定手册》及文献中生化反应项目[12,13], 通过溶血反应阳性可判断其区别于枯草芽孢杆菌，符合解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的生化特点。研究证明，贝莱斯芽孢杆菌作为解淀粉芽孢杆菌的同物异名菌，二者亲缘关系较近(74%～89%)，暂无法区分。因此，B61菌株可初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌。

表4 B61菌株的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain B61

2.3.3 gyrB基因测序结果

B61菌株初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌，选择gyrB基因片段扩增测序，再度进行区分。将序列与Blast对比后选择相似度高的参考菌株作系统进化树，见图3。可见B61与贝莱斯芽孢杆菌的亲缘关系比较近，故鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。

图3 B61与参考菌株的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of strain B61 and reference strains

2.4 B61菌株生长曲线及产酶曲线

为了考察B61菌株的生长能力及产酶能力，绘制其生长曲线及产酶曲线，结果见图4。可见菌株生长2 h后便进入对数期，生长14 h后进入稳定期，18 h后进入衰亡期。菌株生长6 h后可检测到豆豉纤溶酶活性，生长到16 h时酶活性达到最高，为826.25 IU/mL，继而稳定至20 h，然后缓慢下降。产酶曲线与生长曲线具有一定的同步性。

图4 B61的生长曲线与产酶曲线Fig.4 Growth curve and enzyme production curve of strain B61

3 讨论

本研究以收集云、贵、川地区水豆豉为原材料，利用不同培养基对分离菌株进行产酶能力的初步筛选，平板法发现细菌产蛋白酶、淀粉酶、豆豉纤溶酶的比例分别为98.7%、83.5%、98.7%。再从中选择产酶能力较强的6株菌进行化学法复筛，得到产酶能力最强的菌株B61，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。该菌是Ruiz-Garcia等[15]于2005年新命名的芽孢杆菌种，随后被Wang等[16]确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体。所以贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的亲缘性较近，但目前未见能将二者分开的生化反应标准，第八版的伯杰细菌手册中，也未见具体描述贝莱斯芽孢杆菌的生化反应。Fan B等[17]于2007年提出贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌在ANI和dDDH上的区别是在区分物种的界值以下的，所以建议都纳入解淀粉芽孢杆菌组。因此，在GenBank中，贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌也均属于Bacillusamyloliquefaciens。Hee C B等[18]对解淀粉芽孢杆菌组的3个菌种基因进行了分析，发现贝莱斯芽孢杆菌富含次生代谢产物合成的相关基因，也有更多参与抑菌化合物合成的基因。

目前关于贝莱斯芽孢杆菌产豆豉纤溶酶能力的相关发现较少，仅查看2019年Yao Z等[19]从传统海鲜发酵物中分离到1株产豆豉纤溶酶的贝莱斯芽孢杆菌。在本研究中，该贝莱斯芽孢杆菌的生长曲线2～14 h为对数生长期。不同文献中同一种菌的生长曲线略有差异，吴拥军等[20]报道枯草芽孢杆菌的对数生长期为5～10 h，解淀粉芽孢杆菌为2～16 h，与贝莱斯芽孢杆菌接近。张旭等报道解淀粉芽孢杆菌的豆豉纤溶酶活性在2 h即能检测出，在24 h达到最大值，而本研究中，6 h可检测到豆豉纤溶酶活性，16 h达到最大活性，造成差异的可能原因是该文献采用的化学法，检出限相对于平板法较低。

4 结论

本研究采用平板法初筛和化学法复筛相结合的方法，从四川、云南和贵州收集的11种市售水豆豉样品中筛选出1株高产纤溶酶菌株B61，经过一系列生理生化特征分析，并结合gyrB基因测序分析，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌，且该菌株在16 h后检测到最高豆豉纤溶酶活力，为826.25 IU/mL。

综上所述，B61菌株无论作为纤溶酶生产菌还是水豆豉发酵菌株，均具有优良性能，也为进一步开发成为溶血栓药物提供了生物菌株和数据参考。