泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的克隆表达

吴长力，陈颖琪，陈桂柳，林梦哲，张宏梅

(广东工业大学 生物工程系， 广州 510006)

亚硝酸盐广泛存在于咸鱼、腌制肉类和腌制蔬菜中，过量的亚硝酸盐除了能与人体内蛋白质的降解物结合生成强致癌物质亚硝胺外，还可与血红蛋白结合而造成正铁血红肮症，对人体危害极大。有报道指出各地区亚硝酸盐中毒事件逐年增加，所以食品中亚硝酸盐的污染情况及其控制已成为食品安全相关领域研究的一大热点[1-4]。在食品及其配料的亚硝酸盐清除方法中，比较有效的降解方法是生物降解法。目前报道较多的是乳酸菌对发酵食品中亚硝酸盐的降解，如Hashimoto等人在泡菜中添加乳酸菌，发现亚硝酸盐含量明显降低[5]；另外，在发酵食品如香肠、咸鱼和泡菜中，已筛选出许多能降解亚硝酸盐的乳酸菌株，如植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、沙克乳杆菌(Lactobacillussakei)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)等[6-8]。有关乳酸菌降解食品中亚硝酸盐的研究机理表明, 这些乳酸菌在生物发酵后期, 主要通过亚硝酸还原酶来降解亚硝酸盐。该酶是植物硝态氮同化过程中的一个十分重要的酶，所以，获得来源丰富和高效的亚硝酸盐还原酶是实现食品中亚硝酸盐降解的重要途径。

本研究前期在泡菜中分离了一株可高效降解亚硝酸盐，并通过菌种鉴定的植物乳杆菌L10(LactobacillusplantarumL10)，在此基础上，本研究通过基因工程技术，将植物乳杆菌中获得的nirS基因导入到大肠杆菌中进行表达，并诱导产生重组亚硝酸盐还原酶，旨在为该酶在食品安全领域中的实际应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

MRS培养基:购自青岛海博技术有限公司；TaKaRa切胶回收试剂盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、T4 DNA连接酶、限制性内切酶(Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ)：购自大连宝生物工程有限公司；DL2000 DNA Marker、蛋白质分子量Marker、pET-32a(+)表达载体、大肠杆菌BL21(DE3)：购自广州鼎国生物科技有限公司。

实验所用的植物乳杆菌(LactobacillusplantarumL10)从潮汕泡菜(购于广东揭阳)中分离筛选所得；大肠杆菌DH5а为实验室保存菌株；亚硝酸盐还原酶基因引物序列为[9]：

NF 5′-GCGGATCCATGAGTCAAAGCTTATG-3′(下划线Bam H Ⅰ酶切位点)；

NR 5′-CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTG-3′(下划线Xho Ⅰ酶切位点)。

pET-32a(+)质粒重组鉴定引物：

T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；

T7t：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′；

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1nirS基因的克隆

采用SDS-CTAB法提取植物乳杆菌的全基因组DNA，以其为模版用引物NF和NR对nirS基因进行扩增：反应程序(25 μL)为：90 ℃，4 min；94 ℃，45 s；61 ℃，45 s；72 ℃，1 min；30个循环，72 ℃延伸10 min。获得产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测[10]。利用切胶回收试剂盒对目的基因进行纯化，纯化后的nirS基因与pMD 19-T Vector载体过夜连接，后转化到大肠杆菌DH5а感受态细胞中。将转化菌涂布到含有50 mg/mL Amp、24 mg/mL IPTG和20 mg/mL X-gel的LB平板上[11]进行筛选，挑取阳性克隆子进行扩大培养。利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，并用限制酶Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切消化鉴定，目的基因纯化后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得结果通过NCBI网站的Blast进行序列比对，构建成功的质粒命名为pMD 19-T-nirS。

1.2.2 表达质粒pET-32a(+)-nirS的构建

将克隆所得质粒和质粒pET-32a(+)分别用限制酶Bam H Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切消化：ddH2O 6 μL，质粒10 μL，缓冲液2 μL，限制酶Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ各1 μL，为20 μL体系，37 ℃酶切6 h，切胶回收纯化，用T4 DNA连接酶将酶切后的两组分连接过夜，得到重组质粒转化到大肠杆菌DH5а感受态细胞中，然后涂布到含有50 μg/mL Amp的LB平板上，挑取阳性菌株进行扩大培养，提取质粒后用T7、T7t引物进行质粒PCR鉴定和凝胶电泳鉴定，所得PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，构建成功的重组质粒命名为pET-32a(+)-nirS。

1.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达

将提取的质粒pET-32a(+)-nirS转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，取100 μL转化后的表达菌株涂布到含50 μg/mL Amp的LB平板上，挑取阳性菌株进行PCR鉴定；将含质粒pET-32a(+)-nirS的菌株以1∶100接种到含有50 μg/mL Amp的LB液体培养基中，37 ℃培养至OD600为0.6(大约5 h)，加入诱导剂IPTG使其最终浓度为1 mmol/L，37 ℃中继续培养4 h诱导表达，以未诱导表达培养的菌株为阴性对照。分别取菌液20 mL，于4 ℃，4000 r/min离心10 min收集菌体，用预冷PBS(pH 7.4)冲洗2遍后重悬，超声裂解5 min，每次2 s，间隔5 s，功率500 W，于4 ℃，12000 r/min离心10 min，分别收集上清液和沉淀，通过SDS-PAGE电泳检测表达情况。

1.2.4 重组酶的复性

由实验1.2.3的结果可知，目的蛋白以包涵体的形态表达[12]，因此需要对包涵体进行复性，才可检测其酶活。诱导表达后的重组细菌超声裂解后离心，所得沉淀用预冷的缓冲液(2 mol/L尿素、0.1 mol/L Na2H2PO4、0.01 mol/L Tris-HCl、0.6% Triton-100)低温洗涤2遍，离心后沉淀用裂解液(8 mol/L 尿素、0.1 mol/L Na2H2PO4、0.01 mol/L Tris-HCl、pH 8.0)重悬，25 ℃中孵育6 h溶解包涵体，离心后对上清液进行尿素梯度透析复性：依次将包涵体放在尿素浓度为4 mol/L、2 mol/L和PBS缓冲液(均含1 mmol/L EDTA)中透析8 h[13-15]，最后得到复性后的目的蛋白。

1.2.5 重组酶的酶活测定

酶活测定所需反应液的配制：0.1 mol/L Na2HPO4、0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH 6.0)、0.1 mol/L NaCl、0.01 mol/L Na2S2O4，0.01 mol/L甲基紫精(MV)；重组酶酶活测定按照体系：80 μL反应液、20 μL亚硝酸钠(100 mg/L)、100 μL适当浓度酶液加入到1.5 mL EP管中，于37 ℃反应15 min，剧烈震荡结束反应；沸水浴反应3～5 min后低速离心5 min，取100 μL上清液于5 mL比色管中采用格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐浓度[16]，酶活力计算公式如下：

式中：Y为酶活力(U/mg，U表示降解1 ng亚硝酸盐所需要的时间)；X为降解亚硝酸盐的量(ng)；t为酶催化时间(min)；M为参加反应的酶液浓度(mg/mL)。

2 结果

2.1 nirS基因的扩增

以植物乳杆菌基因组DNA为模版，经PCR技术扩增得到nirS基因，再由1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1。在1000～2000 bp之间有明显单一条带，与预期的1500 bp左右目的片段相符[17，18]，PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序后，经NCBI比对确认为植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶基因，大小为1638 bp。

图1 nirS基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of nirS gene

注：M为10000 bp Marker；1为nirS基因PCR扩增产物。

2.2 T克隆载体的鉴定

将转化了pMD 19-T-nirS质粒的阳性菌株扩大培养，提取质粒后进行双酶切消化鉴定，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。酶切消化后的pMD 19-T-nirS质粒分成2个条带，1000～2000 bp的条带为nirS基因，而另一条带为pMD 19-T Vector质粒条带，与预期结果相符，pMD 19-T-nirS克隆质粒构建成功。

图2 T克隆载体双酶切鉴定Fig.2 Identification of T cloning vector by double enzyme digestion

注：M为10000 bp Marker；1为pMD 19-T-nirS质粒双酶切产物。

2.3 重组质粒pET-32a(+)-nirS的鉴定

筛选所得阳性菌株重新提取质粒，用T7、T7t启动子引物进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳图见图3。其中可见只有1条条带在2000 bp左右处，符合预期结果，经测序,所得结果经过NCBI中的Blast进行序列比对后确定含有nirS基因，所以重组质粒pET-32a(+)-nirS构建成功。

图3 重组质粒pET-32a(+)-nirS的PCR鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-nirS by PCR

注：M为10000 bp Marker；1为T7启动子引物PCR结果。

2.4 重组酶的SDS-PAGE电泳检测及酶活测定

图4 重组菌株表达蛋白的SDS-PAGE鉴定Fig.4 Identification of recombinant strain expressed protein by SDS-PAGE

注：M为100 kDa Marker；1为上清液蛋白质鉴定；2为沉淀蛋白质鉴定。

重组菌株经过诱导表达后，对菌液进行超声波裂解，离心所得上清液及沉淀经过SDS-PAGE电泳检测结果见图4，上清液并没有明显的蛋白质条带，而沉淀物在75～100 kDa之间有一条明显条带，与预期条带大小相符，故nirS基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达形成包涵体。通过低浓度尿素梯度稀释法对包涵体进行复性后，获得12.37 mg具有酶活力的重组蛋白，并测得其酶活力为2131.5 U/mg。

3 结论

亚硝酸盐还原酶大多为胞内酶，现已在高等植物、藻类植物和各种微生物中发现其存在。植物细胞中，nirS主要存在于叶绿体和非绿色组织中的质体中[19]；微生物中，nirS常见于反硝化细菌中，如：Pseudomonasaeruginosa[20]，AlcaligenesfaecalisS-6等，但这些菌株均可能存在食品安全隐患，来自食用泡菜中筛选得到的乳酸菌基因组DNA，可在菌株来源上具有相对安全保障[21]。

有关研究表明，利用亚硝酸盐还原酶来降解亚硝酸盐，方法之一是直接将产亚硝酸盐还原酶的乳酸菌加入到发酵产品之中。Peiman Esmaeilzadeh等在发酵香肠时分别加入Lactobacillusplantarum，Lactobacillusfermentum和两种菌混合制成的发酵剂[22]，发现在发酵4 d后，接种了菌株的香肠中亚硝酸盐含量明显比自然发酵的低中，但是，接种了菌株的香肠中，乳酸含量更高且pH值更低，改变了已有的食品品质。此外，有人提出从发酵乳酸菌中分离提纯出亚硝酸盐还原酶后以酶制剂的形式使用。陈浩等将干酪乳杆菌分次诱导发酵2次后，经过溶菌酶和超声波破碎后分离提纯该酶，从1 L发酵液中纯化得到了0.54 mg活性蛋白，比活力为1851.2 U/mg[23]。这种方法的缺点是步骤冗长，获得的产量较低。本研究从泡菜中筛选得到高效降解亚硝酸盐的植物乳杆菌，利用基因工程技术将植物乳杆菌中的nirS基因转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，获得以包涵体形式存在的nirS后，利用低浓度尿素梯度稀释法进行复性，最后从200 mL发酵液中得到有活性的粗酶液12.37 mg，比活力为2131.5 U/mg。这种方法具有原料消耗低、快捷、高效以及不会改变产品风味等优点。但是，由于亚硝酸盐还原酶异源表达后以包涵体形式存在，而包涵体的复性率都较低，所以今后的研究需要针对亚硝酸盐还原酶包涵体的复性程序进行进一步的优化。