盐胁迫对向日葵幼苗生长及生理特性的影响

凌云鹤,周 瑶，景 兵,李春莲,肖恩时,王中华

(西北农林科技大学农学院，陕西 杨凌 712100)

由于经济和工业高速发展，土壤盐渍化使大面积土壤资源难以利用，严重制约我国农林业生产发展和生态环境的改善，因此合理开发和利用大面积的盐渍化土地，筛选耐盐植物资源，改善盐渍化土地生态环境成为我国农林业生产中的迫切任务。栽培向日葵(HelianthusannuusL.)属菊科向日葵属，双子叶植物栽培种，起源于北美西南部[1]。其具有高产、出油率高，能耐受干旱、易存活、耐贫瘠、适应性强等优良特性，也是瘠薄旱地和盐碱地重要的油料作物[2]。但由于驯化过程中的遗传瓶颈，栽培向日葵缺乏必要的变异性以适应不断变化的生物和非生物条件，如颜宏等[3]发现，各种盐溶液浸种对向日葵种子萌发的影响依次是NaHCO3>混合盐>NaCl。王桂芹等[4]从解剖学角度分析不同品种向日葵耐盐性发现，低浓度的盐处理能促进向日葵种子的萌发，并可以缩短种子的萌发周期。唐奇志等[5]利用海水处理向日葵幼苗，也发现低浓度盐处理能促进向日葵的生长发育。孔东等[6]发现当土壤盐分过高时，就会使植株生长发育缓慢，产量降低，甚至个别向日葵品种直接枯萎死亡。张俊莲等[7]在生理方向进行研究，发现盐胁迫对向日葵的所有细胞器伤害都非常大，表现为随着盐浓度的提高细胞器受到不同程度的损伤，且都呈现上升趋势，导致其功能也随着下降，甚至完全丧失。为了克服驯化种质中的这种缺陷，育种者利用野生物种来扩展遗传变异性以掺入到优良的向日葵繁殖种群中，如刘海学等[8]在不同盐浓度的MS培养基上分别诱导培养后得到了不同耐盐程度的新向日葵株系，并已选育出几种比较耐盐的品种。银叶向日葵(H.argophyllus)是栽培向日葵的最近亲属[1]。由于银叶向日葵生长在干旱地区，有时也生长在海洋附近的土地上，因此有人认为它可能是耐盐等位基因的良好来源[9]，也可用作向日葵改良中有利等位基因的供体[9]，并且它被认为是对非生物胁迫的耐受性来源[10]，目前国内外对向日葵耐盐性的研究不多，因此研究银叶向日葵耐盐的形态和生理机制对于提高栽培向日葵耐盐性具有重要意义。本研究以不同品种的向日葵幼苗为研究对象，采用250 mmol·L-1NaCl盐溶液胁迫7 d的方法，进行了幼苗生长状况的调查，通过分析比较银叶向日葵与油葵自交系盐胁迫前后的形态变化以及叶片中的叶绿素、脯氨酸、丙二醛含量及SOD活性等生理指标差异，来探究银叶向日葵耐盐的形态和生理基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

供试材料为银叶向日葵ARG1807(Wt)，对照材料为陕葵2号的保持系(HA)和恢复系(HL)，所有材料均源于西北农林科技大学农学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室。

采用土培盆栽试验，营养钵大小为7 cm×7 cm，每盆装入200 g湿润培养土。每盆精选籽粒饱满均匀且无病虫害的种子8粒，播后正常供应水分，幼苗生长至2叶1心时间苗，每盆定苗2株。4叶1心后开始进行250 mmol·L-1NaCl盐胁迫处理。分别于盐胁迫7 d后的上午10∶00，随机选择经过处理(NaCl)及未经处理(对照，CK)的植株叶片，用剪刀取下位于中部的叶片，将其分别放入取样袋，然后放进有冰块的保温箱中，迅速带回实验室。在实验室用液氮处理后将其放入-80℃冰箱保存，用于后续试验指标的测定[11]，每个指标设置3个生物学重复。

1.2 试验方法

1.2.1 形态指标的测定 株高用直接测量法；叶面积用PC+相机法测定；生物量用烘干后称重法测定[12]。

1.2.2 生理指标的测定 叶绿素含量(Chl/mg·g-1)测定采用乙醇比色法[13]；使用Li-6400便携式光合测定仪(Li-Cor6400，USA)测定光合参数，包括：光合速率(Pn/μmol·m-2·s-1)、气孔导度(Gs/mol·m-2·s-1)、胞间二氧化碳浓度(Ci/μl·L-1)以及气孔限制值(Ls/%)[12]；采用茚三酮比色法测定脯氨酸含量(Pro/μg·g-1)[13]；丙二醛含量(MDA/μmol·L-1)的测定用硫代巴比妥酸法[13]。超氧化物歧化酶(SOD/U·g-1)活性用氮蓝四唑法测定[13]；过氧化氢酶活性(CAT/ U·g-1·min-1)采用紫外吸收法测定[13]；过氧化物酶活性(POD/U·g-1·min-1)采用愈创木酚比色法测定[13]。离体叶片在暗处充分供水后，称量鲜重，静置于相同的环境条件下，每隔0.5 h进行称重，计算各时间点的离体叶片失水速率[14]。以上指标的测定均重复3次，取平均值。

1.3 数据处理与分析

采用Microsoft Execl 2013和STSTSYS软件进行实验数据的处理与差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对向日葵幼苗生长的影响

由图1可知，与正常供水相比，盐胁迫处理下参试品种向日葵的株高、叶面积(7 d)以及根、茎、叶生物量(7 d)均有所降低。 HA、HL以及Wt的株高增量分别比对照减少了58.22%、40.32%和24.53%；叶面积增量分别比对照减少了54.31%、46.70%和38.21%。比较不同品种下降幅度可以看出，Wt的株高、叶面积增量降幅最小，HA降幅最大。 HA、HL的株高增量、叶面积增量与CK相比差异显著(P<0.05)，Wt的株高增量、叶面积增量与CK差异不显著(P>0.05)，反映出盐胁迫对Wt株高、叶面积的影响较小。生物量的研究表明，盐逆境下各品种向日葵的根、茎及叶生物量均小于CK且差异不显著(P>0.05)。

注：CK—对照；NaCl—250 mmol·L-1NaCl处理；**表示CK与NaCl处理在0.01水平上差异显著，*表示CK与NaCl处理在0.05水平上差异显著。下同。 Notes: CK—control; NaCl—salt treatment. ** indicates that CK and NaCl treatment differ significantly at P<0.01 level. * indicates significant difference at P<0.05 level between CK and NaCl treatment. The same below.图1 盐胁迫7 d向日葵的生长特性Fig.1 Growth characteristics of sunflower under salt stress for 7 days

2.2 盐胁迫对向日葵光合生理特性的影响

在250 mmol·L-1NaCl处理后，各品种叶绿素含量呈现出明显的下降趋势(图2A)，HA、HL、Wt的叶绿素含量分别比对照下降了 28.34%、40.59%、3.81%，HL的变化幅度最大。经过差异显著性分析，盐处理下的HA、HL与CK间的差异达到显著水平(P<0.05)，Wt的差异未达到显著水平，反映了盐胁迫对Wt的影响小。从图2B、C中可以看出盐逆境下Pn和Gs值呈极显著(P<0.01)下降。从图2D、E中可以看出各向日葵品种在盐胁迫后Ci值极显著(P<0.01)低于对照，导致气孔限制值Ls显著上升。这充分说明了盐逆境与向日葵的光合速率有很大关系，它可能会导致向日葵气孔关闭，也可能会直接破坏其光合系统，使向日葵的光合速率显著下降。

图2 盐胁迫7 d向日葵的光合参数Fig.2 Photosynthetic parameters of sunflower under salt stress for 7 days

2.3 盐胁迫对向日葵耐盐生理指标的影响

2.3.1 脯氨酸含量 盐逆境下，植株通过积累渗透物质，降低渗透势，保证细胞可以继续从外界吸水[15]。在盐胁迫7 d时，各参试品种与CK脯氨酸含量差异均达极显著水平(P<0.01)，见图3。HA、HL、Wt的脯氨酸含量分别比对照增加了 176.10%、277.87%、279.94%。各品种增加幅度为Wt>HL>HA，说明Wt在盐胁迫下能够积累更多的脯氨酸，来增强其渗透调节能力，缓解逆境压力，抗盐能力较强。

2.3.2 丙二醛及保护酶活性 从图4可以看出，正常条件下3个品种的MDA含量处于较低水平，在250 mmol·L-1NaCL处理下，3个品种MDA含量分别比对照增加了352.62%、85.22%、231.10%。

比较盐胁迫下不同品种SOD、POD及CAT的增幅，可发现盐逆境下，Wt叶片的SOD增幅为65.09%，POD活性的增幅为211.11%，CAT活性的增幅为55.91%，盐胁迫下Wt的SOD、POD及CAT增幅均高于其他两个品种，表明Wt清除活性氧的能力较好，耐盐性较强。

2.3.3 叶片表型及失水速率 为进一步探究3个向日葵品种在非气孔因素方面的差异，对向日葵叶片表型进行观察发现：Wt的叶片表皮毛长度及密度远远多于HA和HL，且其下表皮表皮毛数目显著多于上表皮，而HA及HL上表皮表皮毛的长度及密度均多于下表皮(图5)。

图3 盐胁迫7 d向日葵的脯氨酸含量Fig.3 Proline content of sunflower under salt stress for 7 days

图4 盐胁迫7 d向日葵的MDA含量以及SOD、POD、CAT酶活性Fig.4 Contents of MDA and the activity of SOD,POD and CAT in sunflower under salt stress for 7 days

注：图(a)、(c)、(e )分别为HA、HL、Wt的上表皮；图(b)、(d)、(f)分别为HA、HL、Wt的下表皮。 Note: figues (a),(c) and (e) are the upper epidermis of HA, HL and Wt, respectively; figues (b), (d) and (f) are the lower epidermis of HA, HL and Wt， respectively.图5 向日葵叶表面扫描电镜图(30×)Fig.5 Scanning image at electron microscope of sunflower leaf surface

图6 向日葵叶片失水速率Fig.6 Water loss rate of sunflower leaf

由图6可见，随着时间的变化，3个向日葵品种叶片失水速率均显著上升。HA的叶片失水速率一直高于其他两个品种；在30 min之后，可以明显看出Wt的叶片失水速率一直低于HA、HL,在失水时间为150 min时，HA的失水速率最高，达84%；Wt的叶片失水最慢，失水速率为69%，说明Wt在叶片保水方面具有显著优势，可能是由于其叶片表面密生表皮毛。

3 讨论与结论

当植物遭受盐胁迫时，会出现一系列的可见表现，如生长速率减慢，叶色变淡乃至叶片脱落，甚至是植株死亡等；同时生理指标也会发生改变，如丙二醛和脯氨酸含量增加[16-18]，光合速率减慢[16,19]，膜透性增大[18]等。不同植物因其组织结构和生理功能不同，耐盐能力也有所差异。本试验发现，250 mmol·L-1的高浓度NaCl胁迫会对向日葵的生长造成伤害，HA、HL的株高、叶面积及生物量均显著下降(P<0.05)，表明盐胁迫对它们的生长造成了损伤且对其生物学产量的积累产生了抑制作用。而Wt表现为株高和叶面积与对照相比无明显差异(P>0.05)。王新伟等[20-21]发现盐胁迫阻碍马铃薯的生长与发育，使其出苗率降低、产量下降。丁顺华等[22]认为盐胁迫会影响小麦出苗时间和出苗率。Munns[23]等经过研究发现，植株若长期处在盐逆境中，会导致其叶面积缩小。本研究与上述研究结果基本一致。

在盐胁迫条件下，衡量植物耐盐性的生理指标之一是叶片光合色素含量。叶绿素是植物进行光合作用的最主要色素，叶绿素含量的变化在一定程度上能反映植物进行光合作用的强度[12]。本试验表明，经盐胁迫处理后，叶绿素含量下降幅度：HL>HA>Wt，说明Wt相较于HA、HL来说，所受盐逆境影响较小。植物与环境CO2和水汽的交换通过改变气孔开度等方式进行[12]，从而调节光合速率与蒸腾速率来适应逆境环境。叶片光合速率降低一般为气孔和非气孔两个原因，主要依据Ci和Ls的变化方向来进行判定，当Ci降低、Ls升高时，主要是由于气孔因素；Ci升高而Ls下降则非气孔是主要因素[24-25]。本试验发现在盐胁迫处理后参试向日葵的Ci均显著下降，而Ls显著上升，说明向日葵光合速率显著降低主要是由于气孔因素，其中气孔导度降低，CO2供应不足，限制了光合的顺利进行。

有研究表明，番茄表皮毛的不同密度和类型与其抗逆效果的关系非常紧密，表皮毛丰富的番茄可能具有抗冷的特性，经过相同的胁迫处理发现，很多表面带有致密绒毛的野生番茄在冷害下比其他不具备致密腺毛特征的普通番茄的生存率更高[36]。相关文献表明，在植物受到来自外界的胁迫如冷害、干旱以及病虫危害时，表皮毛会通过自身的免疫反应产生某些防御化合物，从而保护植物不受侵害[37]。本研究中Wt的光合速率降低，主要是气孔因素，与栽培向日葵并无差异，而Wt叶片表面密生表皮毛，与栽培向日葵相比，在降低叶片失水速率方面具有显著优势，说明Wt失水速率慢与非气孔因素相关，有待于进一步研究。