微小RNA-218对耐顺铂宫颈癌细胞生物学特性影响的研究*

2019-09-14苏瑞芬

国际检验医学杂志 2019年15期

邵琼,苏瑞芬,许海

(1.湖北省来凤县人民医院妇产科,湖北恩施 445700;2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院妇产科，湖北恩施 445000;3.湖北中医药大学黄家湖医院妇科，湖北武汉 430070)

宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中高居第二，除手术治疗外，化疗也是重要的治疗手段之一[1]，顺铂是临床上治疗宫颈癌的一线化疗药物，但由于各种复杂的机制，相当一部分患者会因为对顺铂产生耐药性而导致化疗失败[2-3]。增加耐药细胞对顺铂的敏感性是挽救耐药病例的一个重要研究思路。研究发现微小RNA(miRNA)在宫颈癌中表达异常[4]。microRNA 是一类非编码单链小RNA，核苷酸长度为18～25个，可以通过调控活性靶点而参与肿瘤的发生[5]。其中miRNA-218(miR-218)在宫颈癌中的表达显著降低，可能是潜在的肿瘤抑制因子[6]。目前，有关miR-218对于耐药宫颈癌细胞作用的研究较少。本研究建立了耐顺铂的宫颈癌细胞株，并使其过表达miR-218，观察了耐药细胞生物学特性的改变，取得了一定的研究成果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验材料人宫颈癌细胞SiHa细胞系购于北京中原公司；顺铂购于齐鲁制药公司；DMEM培养基、10%胎牛血清、青霉素、链霉素、0.25%胰蛋白酶购于Gibco公司；慢病毒载体质粒、miRNA-218基因片段购于上海吉玛公司；miRNA快速提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒购于北京天根公司。流式细胞仪为美国BD公司生产。Transwell小室由美国Corning公司生产。

1.2细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中加入双抗(100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)，将SiHa细胞置于培养基中，当细胞融合率达到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，于5%CO2培养箱中进行培养，保持恒温37 ℃。

1.3耐顺铂宫颈癌细胞株培养通过持续缓慢增加顺铂浓度的方法建立耐药细胞株[7]，在SiHa细胞培养液中加入0.1 μg/mL低浓度的顺铂，持续作用2周后，待细胞可在此浓度中稳定生长，再将顺铂浓度增加至0.5 μg/mL，6周后增加至1.0 μg/mL，12周后加至1.5 μg/mL，8周后加至2.0 μg/mL，11周后观察在培养液中仍稳定增殖的细胞株即为耐顺铂SiHa细胞株(耐顺铂SiHa)。

1.4miR-218过表达耐顺铂SiHa细胞株建立及表达检测将miR-218 序列和阴性对照序列扩增并克隆到慢病毒质粒LV3上，miR-218 基因片段为5′-TTG TGC TTT TGT GCT TGA TCT AAC CAT GT-3′，阴性对照为5′-TTC TCC GAA CGT GTC ACG TTT C-3′，严格按照产品操作手册进行转染耐顺铂SiHa细胞，在96孔板中每孔加入100 μL完全培养基，接种耐顺铂SiHa细胞3.5×103，感染细胞病毒滴度为1×107TU/mL，并加入0.5 g/L的聚凝胺，72 h后用荧光显微镜下观察细胞发光情况，加入1.2 mg/L嘌呤霉素杀死未转染细胞，筛选出的细胞即为过表达miR-218的耐顺铂SiHa细胞株(miR-218/耐顺铂SiHa)，期间根据细胞的生长状况进行传代培养。获得稳定生长表达的细胞株后，按照miRNA快速提取试剂盒说明严格操作，提取SiHa、耐顺铂SiHa、miR-218/耐顺铂SiHa 3组细胞的RNA，逆转录合成cDNA，按照逆转录试剂盒进行扩增，采用荧光定量PCR试剂盒检测各组细胞miRNA-218的表达量。

1.5MTT法检测细胞在顺铂中的增殖情况采用0.25%胰蛋白酶消化SiHa、耐顺铂SiHa、miR-218/耐顺铂SiHa 3组细胞，调整细胞数量，离心后接种于96孔板，同时采用0.4 μg/mL的顺铂处理，采用MTT法测定吸光度(A)值，连续测量7 d，根据A值绘制生长曲线反映细胞增殖活力。

1.6顺铂药物敏感性测定采用0.25%胰蛋白酶消化3组细胞，调整细胞数量，离心后接种于96孔板，并分别用0、0.000 4、0.004、0.04、0.4、4、40 μg/mL浓度顺铂处理，72 h后采用MTT法测定吸光度，计算IC50。

1.7划痕试验将细胞接种于96孔板中，采用3%胎牛血清培养，待细胞汇合达85%时，用移液枪枪头沿孔底做一直径的笔直划痕，并吹走划落细胞，分别在0、24 h时在200倍显微镜下观察和测量划痕闭合宽度。

1.8Transwell法测定细胞侵袭能力 0.25%胰蛋白酶消化3组细胞，调整细胞数量，使用无血清培养基重悬，在小室下室加入10%血清培养基600 μL，小室上室加入150 μL细胞悬液，放入5%CO2的培养箱中，恒温37 ℃培养10 h后甲醛固定小室，结晶紫染色，底膜切片移至载玻片中性树胶封片，200倍光镜下随机取5个视野计数细胞数取平均值，即为穿膜细胞数。

1.9统计学处理应用SPSS19.0分析软件，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组细胞miR-218的表达量以SiHa组细胞为对照组,其miR-218的相对表达量为1.00±0.00。miR-218/耐顺铂SiHa组细胞的miR-218相对表达量为5.26±0.34，显著高于SiHa组(t=20.65,P<0.05)。耐顺铂SiHa组细胞的相对表达量为1.43±0.21，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，低于miR-218/耐顺铂SiHa组(t=18.76,P<0.05)。耐药株细胞的miR-218表达量与亲本株差异无统计学意义，SiHa细胞发生耐药的过程可能无miR-218参与，转染miR-218后表达量显著增加，证实转染成功。

2.2各组细胞在顺铂中的增殖克隆及IC50在含0.4 μg/mL的顺铂培养液中，采用MTT法检测细胞增殖情况，连续5 d，根据所测得的A值绘制生长曲线，见图1。在1～2 d，3组细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05)；3～5 d时，耐顺铂SiHa组的增殖显著高于miR-218/耐顺铂SiHa组，差异有统计学意义(P<0.05)，miR-218/耐顺铂SiHa组与SiHa组之间增殖水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。耐顺铂SiHa 组的IC50显著高于SiHa组[(0.15±0.03)μg/mL]与miR-218/耐顺铂SiHa组[(0.23±0.06)μg/mL]。

注：从上到下的三条生长曲线依次为耐顺铂SiHa组、SiHa组、miR-218/耐顺铂SiHa组图1 各组细胞生长曲线

2.3划痕试验分别在0、24 h时在200倍显微镜下观察和测量划痕闭合宽度，SiHa、耐顺铂SiHa、miR-218/耐顺铂SiHa组的划痕愈合率分别为(28.16±2.14)%、(29.35±1.86)%、(13.45±1.02)%，miR-218/耐顺铂SiHa组划痕愈合率显著低于SiHa与耐顺铂SiHa组,差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 划痕试验检测各组细胞迁移能力(200×)

2.4细胞侵袭能力 200倍光镜下观察小室底膜细胞数，SiHa、耐顺铂SiHa、miR-218/耐顺铂SiHa组细胞穿膜数分别为123.40±21.65、132.50±22.32、78.90±12.54，miR-218/耐顺铂SiHa组细胞穿膜数显著低于SiHa与耐顺铂SiHa组,差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 Transwell法测定细胞侵袭能力(200×)

3 讨论

从组织学分类，宫颈癌属于鳞癌，人宫颈鳞癌SiHa细胞是最常用于肿瘤研究的细胞系之一。顺铂作为宫颈癌化疗的一线药物效果显著，但临床一旦发生耐药，治疗效果将会受到巨大影响。宫颈癌耐药的发生可能与化疗药物进入肿瘤细胞减少或溢出增多，药物在肿瘤细胞内活性减弱，化疗药物作用的靶分子改变，肿瘤DNA损伤修复能力增强，肿瘤细胞凋亡抑制相关[8]。宫颈癌细胞耐药的机制尚不明确，目前认为这些机制或多或少参与了宫颈癌耐顺铂的过程中。有学者发现耐药株细胞学形态发生了改变，可能通过这种改变增加代谢，增强自身修复能力[9]。建立耐药株模型，研究增加耐药株对药物敏感性的方法具有重大科研和临床价值。耐药株的建立目前有两种方法，一是低浓度持续加量诱导法，优点是细胞耐药性较稳定成功率高；另一种方法是大剂量冲击间断给药法，优点是更接近于临床耐药发生过程。在研究了诸多文献后，本研究采取了前者的造模方式，经过40周的培养，成功获得了耐顺铂SiHa细胞株。

miRNA在癌症发生发展中发挥了重要作用，miRNA是一类高度保守的非编码单链小分子RNA,可通过与多个靶基因的mRNA的3′端的非翻译区发生不完全的互补配对,并在转录后抑制基因的表达。OLIVETO等[10]报道，miRNA可通过扩增表达或减少表达来实现对癌症的抑制，几乎参与了肿瘤发生发展的每一个步骤,在肿瘤发病机制中发挥了重要作用。50%以上的miRNAs定位于肿瘤的相关基因组区域内,并可由染色体异常而导致miRNAs基因拷贝数的改变,进而出现miRNAs的表达失调。几乎所有的肿瘤组织内均可检测出miRNAs的异常表达。miR-218在乳腺癌、肝细胞癌、神经胶质瘤等诸多恶性肿瘤中表达下降[11-13]，JIANG 等[14]研究报道宫颈癌患者血清中miR-218表达量显著低于正常妇女，崔英等[15]发现宫颈癌组织中miR-218的表达量显著高于正常宫颈组织，石玉荣等[16]发现miR-218可以预测宫颈癌的侵袭性，其高表达可能抑制宫颈癌细胞的迁移。在本研究中，将miR-218基因通过慢病毒感染的方式转染入耐药SiHa细胞株，通过PCR荧光定量检测，发现miR-218/耐顺铂SiHa细胞株中miR-218的表达量显著增加，同时发现亲本株细胞与耐药株细胞的miR-218表达量差异无统计学意义(P>0.05)，说明耐药的发生可能与miR-218表达量无关。在含有一定量顺铂的培养基中miR-218/耐顺铂SiHa的增殖速度和IC50显著低于耐药株，但与亲本株无差异，说明虽然耐药的发生过程与miR-218无关，但过量表达miR-218后可以增加耐药株细胞对顺铂的敏感性。之后的划痕试验和Transwell试验均证实了miR-218对耐药株细胞迁移和侵袭能力的抑制，这与目前大多研究结果相一致。

本研究通过持续缓慢增加顺铂浓度的方法成功构建了SiHa耐药株，慢病毒转染法建立了过表达miR-218的SiHa细胞株及耐药株。与SiHa及耐顺铂SiHa相比，miR-218/耐顺铂SiHa细胞株的miR-218表达量显著升高；在含有顺铂培养液中，耐顺铂SiHa的克隆增殖与IC50显著高于SiHa与miR-218/耐顺铂SiHa，miR-218/耐顺铂SiHa的划痕愈合率与细胞穿膜次数显著低于SiHa及耐顺铂SiHa。