脓毒症患者血清来源外泌体对巨噬细胞向M1型极化的影响

2019-09-14李永念祝丽丽罗昭逊

国际检验医学杂志 2019年15期

胡雷，李永念，祝丽丽，罗昭逊

(1.贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳 550003；2.贵州医科大学儿科学院，贵州贵阳 550004)

脓毒症是由重度感染引起的临床综合征，常伴有多种器官功能受损，具有较高的病死率。健康者的免疫和生理反应可以有效地杀伤病原体，这些功能的失调会导致脓毒症的发生，而持续的中性粒细胞、单核/巨噬细胞的活化会加速这个过程。另外，淋巴细胞共刺激分子的表达增多、淋巴细胞凋亡的加速、中性粒细胞凋亡的延迟以及组织细胞坏死的增强均是脓毒症形成的重要机制[1]。单核细胞协同其他吞噬细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和自然杀伤细胞)共同构成人体的固有免疫系统，它们是机体对抗病原体的第一道防线[2-3]。机体受到寄生虫或者细菌感染时，特别是在经典的Ⅰ型炎症环境中，在促炎症因子干扰素(IFN)和肿瘤坏死因子(TNF)等的刺激下，骨髓中的单核细胞会进入血液或者其他组织中，分化为经典活化M1型巨噬细胞，并且常高表达一氧化碳合酶(iNOS)[4]。而在Ⅱ型炎症环境中(如线虫感染或手术后)，在炎症因子IL-4 、IL-13等的刺激下，组织原位的巨噬细胞不依赖骨髓来源的单核细胞而自行增殖分化为选择性活化的M2型巨噬细胞，这类细胞高表达精氨酸酶1[5-6]。外泌体是细胞分泌的囊状微泡，其内包裹大量蛋白、脂类、微小RNA、mRNA、DNAs，用于细胞间信息传递和分子转运。外泌体主要通过调节抗原提呈、活化或抑制免疫细胞、影响免疫监督和细胞间通讯等方式发挥免疫调节功能[7-9]。而外泌体在脓毒症形成过程中的作用还鲜有报道，特别是其是否影响单核巨噬细胞的极化而发挥其免疫调控作用还不清楚。本研究通过收集脓毒症患者血液中的外泌体，并用其刺激人单核细胞系的U937细胞，观察其是否影响细胞的极化，旨在阐明外泌体在脓毒症形成过程中的作用提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料将2016年1月至2017年12月贵州医科大学附属医院ICU收治的脓毒症患者23例纳入研究，男16例、女7例，抽取每位患者血液5 mL用于外泌体的提取。患者均知情同意并签署知情同意书。上述患者均有明显高热和显著的白细胞、炎性反应指标升高，均有致病菌感染，均符合脓毒症诊断标准[1]。纳入标准：(1)年龄≥ 18岁；(2)体温>38 ℃或<36 ℃ ；(3)心率>90 次/分；(4)患者呼吸频率>20 次/分；(5)WBC>12×109/L或<4×109/L。排除标准：(1)伴有恶性肿瘤或免疫缺陷疾病；(2)伴有慢性肾衰竭；(3)伴有急慢性心功能衰竭；(4)伴有血液系统疾病；(5)入院48 h内死亡或者出院的患者。另外，选取23例同期于该院进行体检且年龄匹配的健康体检者作为对照，用同样的方法抽取5 mL血液标本备用。

1.2仪器与试剂 U937细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMSO、LPS和TRIzol均为Invitrogen公司产品，佛波酯(PMA)为MCE公司产品；细胞培养采用的RPMI 1640培养基和无外泌体血清均为Gibco公司产品；ReverTra Ace 实时荧光定量PCR(qPCR)反转录试剂盒、SYBR Green试剂均为TOYOB公司产品；重组人白细胞介素(IL)-4 蛋白、兔抗CD63抗体、兔抗CD9抗体、人IP-10 ELISA 试剂盒 (CXCL10)、人TNF-α ELISA 试剂盒、人 IL-1β ELISA 试剂盒、人肿瘤生长因子(TGF)-β ELISA试剂盒均为Abcam公司产品；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒和SDS-PAGE蛋白凝胶试剂盒均购自碧云天生物技术公司；ECL发光试剂盒为美国millipore公司生产；HRP标记的羊抗兔IgG购自北京鼎国生物技术有限责任公司；血清总外泌体提取试剂为Invitrogen公司产品。低温离心机为Eppendorf公司5810R型；-80 ℃低温冰箱为青岛海尔公司DW-86L626型；倒置显微镜为Nikon公司TS100型；酶标仪为Bio-rad公司680型；凝胶成像仪为ChemiScope公司5600型和qPCR仪为Bio-Rad 公司iQ5型。

1.3方法

1.3.1细胞培养 U937细胞用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行培养，每隔1 d换液，每3 d进行一次传代。用PMA(浓度为100 ng/mL)诱导U937细胞12 h，使其向巨噬细胞分化，以加入同体积的DMSO作为对照；在此基础上分别用LPS(浓度为100 ng/mL)诱导48 h，使其向M1型巨噬细胞分化，或者用IL-4(浓度为20 ng/mL)诱导48 h，使其向M2型巨噬细胞分化；并在PMA刺激后分别用健康者人和脓毒症患者来源的外泌体(浓度为0.1 μg/mL)刺激细胞48 h。

1.3.2外泌体的提取与鉴定将收集的血液室温下静置30 min，在4 ℃离心机1 200×g离心15 min,分装于1.5 mL EP管中,储存于-80 ℃冰箱备用。根据血清总外泌体提取试剂盒操作步骤提取外泌体，用碧云天BCA蛋白定量试剂盒定量后，一部分用PBS重悬用于刺激细胞，另一部分用Western blot的方法检测CD63和 CD9的表达，一抗稀释1 000倍，二抗稀释3 000倍。

1.3.3Real-time PCR 通过TRIzol裂解细胞，并提取总RNA。用ReverTra Ace qPCR反转录试剂盒合成cDNA，并按照SYBR green试剂的实验步骤进行PCR反应。所有目的基因表达量以GAPDH的表达量作为内参，所有目的基因的表达均消除各自内参后得到相对循环阈值(Ct值)，即ΔCt，若要做A与B两组某种基因表达的比较，即A是B的2-(ΔCtA-ΔCtB)倍。引物序列如下,CD68正向：5′-AGG CTG TGG GTG GGA TCA-3′，CD68反向:5′- CTT GGA AAG GAG GAA ATG AAA GTC-3′；CXCL10正向:5′-TTC CTG CAA GCC AAT TTT GTC-3′，CXCL10反向:5′-TCT TCT CAC CCT TCT TTT TCA TTG T-3′；TNF-α正向:5′-GCA GGT CTA CTT TGG GAT CAT TG-3′，TNF-α反向:5′-GCG TTT GGG AAG GTT GGA-3′；IL-1β正向:5′-TCA GCC AAT CTT CAT TGC TCA A-3′，IL-1β反向:5′-TGG CGA GCT CAG GTA CTT CTG-3′；CD206正向:5′-CGC TAC TAG GCA ATG CCA ATG-3′，CD206反向:5′-GCA ATC TGC GTA CCA CTT GTT TT-3′；TGF-β正向:5′-CGC GTG CTA ATG GTG GAA A-3′，TGF-β反向:5′-GCT GTG TGT ACT CTG CTT GAA CTT GT-3′；GAPDH正向:5′ -CTT AGC ACC CCT GGC CAA G-3′，GAPDH反向:5′ -GAT TCT GGA GAG CCC CG-3′。

1.3.4ELISA U937细胞经PMA诱导12 h后，再分别进行IL-4、LPS、健康者血清外泌体和脓毒症患者外泌体刺激48 h，收集培养上清，按照Abcam公司ELISA检测试剂盒说明书实验步骤检测 CXCL10、TNF-α、IL-1β和 TGF-β的水平。

1.4统计学处理用统计分析软件SPSS17.0进行处理，多组间实验数据的比较使用单因素方差分析，两组间的比较用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PMA诱导U937细胞向巨噬细胞样细胞分化 U937细胞是悬浮细胞，经PMA诱导后，大量细胞黏附在培养板底，并有一些细胞长出小的突起，见图1A，且PMA诱导促使巨噬细胞标记分子CD68的mRNA表达明显增加，见图1B，表明PMA可诱导U937细胞向巨噬细胞样细胞分化。

2.2外泌体的鉴定从健康者与脓毒症患者血清提取的外泌体，经PBS重悬后BCA法进行蛋白定量，取10 μg总蛋白，提取的外泌体均明显表达CD63和CD9这两个外泌体的分子标记，见图2。

2.3脓毒症患者来源外泌体对U937-巨噬细胞样细胞形态学的影响 LPS促使U937-巨噬细胞样细胞有更多的突起生成，IL-4对U937-巨噬细胞样细胞的形态无明显影响，脓毒症患者来源外泌体也明显地促使U937-巨噬细胞样细胞的突起生成，这与LPS诱导后的细胞形态相似，而健康者血清来源的外泌体无这种功能，见图3。这表明脓毒症患者来源的外泌体具有M1型巨噬细胞诱导剂相似的功能。

图1 PMA诱导U937细胞向巨噬细胞样细胞分化(×200)

图2 健康者人和脓毒症患者血清来源的外泌体表达CD63和CD9

图3 不同因素刺激下U937-巨噬细胞样细胞的形态学变化

注：*表示P<0.05图4 脓毒症患者来源的外泌体促使U937-巨噬细胞样细胞中CXCL10、TNF-α、IL-1β的转录

2.4脓毒症患者来源外泌体促进U937-巨噬细胞样细胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的转录 qPCR 检测M1型巨噬细胞标记分子(CXCL10、TNF-α、IL-1β)和 M2型巨噬细胞标记分子(CD206、TGF-β)在mRNA水平的表达发现，LPS促使巨噬细胞样细胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的表达增加，IL-4促使巨噬细胞样细胞CD206、TGF-β的表达增加，脓毒症患者来源的外泌体也明显地促使CXCL10、TNF-α、IL-1β表达的增加，这与LPS的效应相似，而健康者血清来源的外泌体无这种功能。见图4。

2.5脓毒症患者来源外泌体促进U937-巨噬细胞样细胞分泌CXCL10、TNF-α、IL-1β LPS使巨噬细胞样细胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌增加，IL-4使巨噬细胞样细胞TGF-β的分泌增加，脓毒症患者来源的外泌体也促进了CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌，这与LPS有相似的功能，而健康者来源的外泌体无这种功能。这表明脓毒症患者来源的外泌体可促使巨噬细胞样细胞向M1型极化。见图5。

注：*表示P<0.05图5 脓毒症患者来源的外泌体促使U937-巨噬细胞样细胞中CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌

3 讨论

脓毒症目前仍是重症医学领域面临的重大难题，每年都有大量患者因此死亡[10]。有研究针对全球37个国家超过11 000名脓毒症患者的资料进行汇总，结果发现有57%的患者是革兰阴性菌感染，有44%的患者是革兰阳性菌感染，11%的患者是真菌感染[11]。可见，脓毒症往往是由病原体感染引起的，这些病原体感染后引发的免疫应答可能是导致多种临床症状的主要原因，抑制病原体和减弱由病原体感染诱导的免疫应答是缓解脓毒症的重要手段。

巨噬细胞因其功能状态不同，可分为M1和M2型。M1型巨噬细胞高表达CXCL10、TNF-α和IL-1β(可作为M1型巨噬细胞的分子标记)[12]。巨噬细胞吞噬细菌后会产生一系列炎症因子，进而激活固有免疫系统来抵御细菌的侵袭[1]，此时的巨噬细胞为M1型。M2型巨噬细胞具有抗炎功能，表现为高表达甘露醇受体CD206和TGF-β[13]。IL-4能促进巨噬细胞CD206的表达增加[14-15]。在疾病发生过程中，巨噬细胞的极化程度取决于其所处的组织微环境[16]。在脓毒症的发生过程中，病原体的持续存在会过度活化体内免疫细胞，导致免疫应答的持续活跃。巨噬细胞作为免疫应答中的重要一环，其向M1型转变会加重脓毒症。

细胞释放的外泌体中含有丰富的蛋白、脂类、microRNA和mRNA，通过这些物质的转运来发挥细胞间信息传递的作用，大量研究表明其也具有调控免疫应答的功能[7]。外泌体因其来源的细胞及所处的微环境不同而发挥不同的免疫调节作用。细菌感染的巨噬细胞来源的外泌体具有明显的免疫调节作用，其具有刺激巨噬细胞和中性粒细胞高表达TNF和iNOS的作用[17]，而且这些外泌体还可增强机体免疫监视的功能[18]。另外，CD4+T细胞来源的外泌体能促进T细胞的活化[19]。成熟树突细胞来源的外泌体可通过TNF信号途径活化免疫反应[20]。相对于以上提到的外泌体所具有的促进免疫应答和炎性反应的作用来说，肿瘤细胞来源的外泌体具有抑制免疫应答和炎性反应的作用[21]。肿瘤细胞来源的外泌体可以有效抑制T细胞和NK细胞活性，并活化粒细胞来源的抑制细胞来发挥免疫抑制作用[22-23]。此外，黑色素瘤细胞外泌体内包裹的Fas配体能通过促进淋巴细胞的凋亡来抑制免疫应答[24]。而在脓毒症形成过程中，体内的免疫细胞可能也会受到外泌体的影响而发生功能状态的改变，从而加剧脓毒症的进程。

在本研究中，为了判断脓毒症患者来源外泌体对巨噬细胞功能的影响，本课题组首先用PMA诱导人U937单核细胞向巨噬细胞样细胞分化[25]，结果发现PMA促使悬浮生长的U937细胞贴壁生长，并长出小的突起，具有了巨噬细胞样的形态特征，而且巨噬细胞的标记分子CD68也表达增加。在此基础上，本课题组采用健康者血清与脓毒症患者来源的外泌体刺激PMA诱导后的U937细胞，并以健康者来源外泌体、IL-4或者LPS刺激作为对照，结果发现IL-4诱导的细胞可有效表达M2型巨噬细胞的标记分子，LPS诱导的细胞可高表达M1型巨噬细胞标记分子，脓毒症来源的外泌体具有与LPS相似的功能，也促进PMA诱导的U937细胞高表达M1型巨噬细胞标记分子，而健康者血清来源的外泌体却没有这种功能。