Fascin、HPA蛋白在丙泊酚抑制人胃癌MKN-45细胞转移中的作用

赖晓红，梁 桦，刘洪珍，王汉兵，李露君

(广东省佛山市第一人民医院麻醉科 528000)

胃癌是常见的恶性肿瘤，由胃癌导致的死亡人数在恶性肿瘤中位居第二，仅次于肺癌，而大多数胃癌患者被发现时往往已处于胃癌晚期[1]。手术是胃癌最重要的治疗方法之一。丙泊酚是胃癌根治术中常用的静脉麻醉药，而关于丙泊酚对肿瘤细胞的作用结果不一致[2-4]。笔者前期研究表明丙泊酚可抑制体外培养的人胃癌MKN-45细胞的转移能力[5]，但具体机制不明。本研究拟探讨丙泊酚抑制人胃癌MKN-45细胞转移能力与Fascin、HPA蛋白表达的相关性，为胃癌患者在麻醉期间用药提供参考。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂和仪器 胃癌MKN-45细胞(中国科学院上海细胞生物医学研究所)，胎牛血清、DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基(Hyclone公司,美国)，丙泊酚(阿斯利康公司，批号NJ059，英国)，Transwell小室(Corning公司，美国)，Matrigel胶(BD公司，美国)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，美国)，兔抗人Fascin蛋白多克隆抗体(CST公司，美国)，兔抗人HPA多克隆抗体、鼠抗人GAPDH抗体(Santa Cruz公司，美国)，倒置光学显微镜(Olympus公司，日本)。

1.2细胞培养 准备好含10 %的胎牛血清，且每毫升含100 U青霉素和100 U链霉素的DMEM高糖培养基，将符合细胞计数要求的人胃癌MKN-45细胞放入培养基，并放入条件为37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。每3～4天用含0.02% 乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶溶液消化，以1∶3传代培养。

1.3丙泊酚干预 细胞培养24 h后，细胞分为5组，分别为加入4、8、16 μg/mL丙泊酚的P4、P8、P16组，不做干预的空白对照组(C组)和丙泊酚的溶剂脂肪乳组(I组)，以上处理时间均为24 h。

1.4细胞划痕实验检测细胞的迁移能力 在6孔板背后用标记笔均匀地划上横线，每道横线相隔5 mm，横穿过孔，每孔5条线。每组取6个培养孔。各组细胞处理后换液，再用丝裂霉素处理1 h。用20 μL移液器枪头比着直尺，垂直于背后的横线进行细胞划痕。洗涤3次后加入无血清培养基并拍照，此时的划痕距离为T0，放入37 ℃、含5% CO2培养箱继续培养24 h后再拍照，此时的划痕距离为T24。计算细胞迁移率=(T0-T24)/T0×100%。

1.5Transwell法检测细胞侵袭能力 于4 ℃溶解Matrigel胶24 h后，取40 μL，加入预冷的Transwell小室，上室和下室用孔径为8 μm的聚碳酸酯微孔膜分隔，于37 ℃下聚合30 min以凝固Matrigel胶。吸走小室中多余的液体，在上室加100 μL无血清RPMI-1640培养基、下室加入600 μL含血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃下放置12 h后洗涤。消化各组MKN-45细胞，每组取6个复孔，用含0.2%牛血清清蛋白(BSA)的培养基重悬，收集细胞。以每室100 μL 的量分别加入上室， 于37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养24 h后取出小室，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤1次，加入0.5%结晶紫染色10 min，后用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，于倒置光学显微镜下观察，计数下室的细胞数(即穿过滤膜的细胞数)，随机选取5个视野，取其平均值。

1.6Western blot法检测人胃癌MKN-45细胞中Fascin、HPA蛋白的表达 胰酶消化收集各组细胞，离心10 min后弃培养液，用PBS清洗，再加入100 μL的细胞裂解液裂解细胞，离心5 min后，取上清液。BCA法进行蛋白定量。取10 μg蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，后冲洗凝胶，将蛋白转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液(含0.1% Tween 20)封闭，后分别加入1∶500稀释的兔抗人Fascin多克隆抗体，1∶500稀释的兔抗人HPA蛋白多克隆抗体，内参为1∶1 000稀释的鼠抗人GAPDH，于24 ℃下孵育4 h，用含0.1%Tween20的TBST洗膜3次，每次15 min，加入1∶2 000辣根过氧物酶体HRP标记的二抗，24 ℃作用1 h，后用TBST避光洗膜3次，每次15 min，后放置暗盒中显影。扫描PVDF膜，进行吸光度(A)值分析，将Fascin和HPA的A值与GAPDH的A值对比，其比值反映Fascin和HPA蛋白相对表达水平。

2 结 果

与C组比较，P4、P8、P16组细胞的迁移能力和侵袭能力降低(P<0.05)，I组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)；随着丙泊酚浓度的增加，细胞的迁移能力和侵袭能力逐渐降低(P<0.05)，见表1，图1、2。与C组比较，P4、P8、P16组Fascin和HPA蛋白表达下调(P<0.05),I组上述指标均差异无统计学意义(P>0.05)；随着丙泊酚浓度的增加，Fascin和HPA蛋白的表达逐渐下调(P<0.05),见图3、表2。

图1 各组人胃癌MKN-45细胞的迁移能力检测(×40)

A：C组；B：I组；C：P4组；D：P8组；E：P16组

图2各组人胃癌MKN-45细胞侵袭能力检测(Transwell×200)

表1 各组细胞24 h迁移与侵袭能力

a：P<0.05，与C组比较；b：P<0.05，与P4组比较；c：P<0.05，与P8组比较

图3 各组人胃癌MKN-45细胞Fascin和HPA蛋白Western blot图

组别FascinHPAC组0.87±0.121.97±0.33I组0.98±0.112.08±0.28P4组0.49±0.13a1.49±0.27aP8组0.27±0.06ab1.01±0.14abP16组0.11±0.02abc0.53±0.16abc

a：P<0.05，与C组比较；b：P<0.05，与P4组比较；c：P<0.05，与P8组比较

3 讨 论

细胞划痕实验可模拟肿瘤细胞迁移的过程，在一定程度上是评价体外肿瘤细胞迁移能力的有效方法；Transwell实验中小室上、下室之间的基质胶与细胞外基质的结构相似，肿瘤细胞分解并穿过基质胶的能力反映了细胞的侵袭能力[6-7]。本研究结果表明，丙泊酚可抑制体外培养的人胃癌MKN-45细胞的迁移和侵袭，且随着丙泊酚浓度的增加，细胞的迁移和侵袭能力逐渐降低，这与笔者前期的研究结果一致[5]。肿瘤细胞转移是癌症患者死亡的重要原因。肿瘤细胞分泌蛋白酶降解细胞外基质和基底膜发生的侵袭过程，以及游离出细胞外基质后发生的迁移过程，是转移能否成功的两个较为关键因素[8]。因此，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭是防止肿瘤细胞转移的重要手段[9]。Fascin蛋白是一种细胞骨架蛋白，在细胞迁移、黏附和细胞间相互作用中起重要作用，在正常上皮结构中几乎检测不到，但在胃癌患者中高度表达。Fascin蛋白的过度表达与胃癌患者的不良预后呈正相关；在小鼠的实验模型中，抑制Fascin蛋白的表达，可抑制肿瘤细胞迁移和体外侵袭，从而减少肿瘤的转移[10-11]。HPA蛋白是一种内-B-D-葡萄糖醛酸苷酶，具有切割细胞表面和细胞外基质中硫酸乙酰肝素的能力，而硫酸乙酰肝素则起着维持细胞外基质稳定性的重要作用，同时HPA蛋白可重塑细胞基底膜的结构，这有利于肿瘤细胞穿破细胞外基质和血管壁，促进肿瘤细胞的侵袭。HPA蛋白在很多肿瘤患者中均高度表达，包括结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌等[12-13]。本研究结果提示，经丙泊酚处理后的人胃癌MKN-45细胞迁移和侵袭能力下降，并随着丙泊酚浓度的增加，其迁移和侵袭能力逐渐下降，同时Fascin、HPA蛋白表达也逐渐下调，提示丙泊酚抑制人胃癌MKN-45细胞转移的作用可能与其下调人胃癌MKN-45细胞中Fascin、HPA蛋白表达，进而抑制细胞的迁移和侵袭能力有关。

综上所述，丙泊酚可呈浓度依赖性地抑制人胃癌MKN-45细胞的迁移和侵袭，其机制可能与下调Fascin和HPA蛋白的表达有关。