头孢他啶纳米粒包被导管对铜绿假单胞菌介导小鼠导管相关性尿路感染的影响*

冯 伟，王 瑜，张定林，李晓宇,3，孙凤军△

(1.陆军军医大学西南医院药剂科,重庆 400038；2.陆军军军医大学基础部化学教研室,重庆 400038；3.中国人民解放军联勤保障部队第980医院邯郸院区药剂科,河北邯郸 056001)

尿道导管主要用于手术期间收集尿液和测量ICU患者的尿量或长期用于治疗输尿管梗阻、尿滞留和尿失禁[1]。伴随医疗技术的进步患者使用尿道导管的比例不断增高，同时使用尿道导管导致的导管相关性尿路感染(catheter associated urinary tract infection,CAUTI)也越来越多，尤其是细菌生物膜感染。在ICU，超过39%的CAUTI是由铜绿假单胞菌和大肠埃希菌引起的[2-3]。而细菌一旦形成生物膜，即可逃避宿主免疫反应的攻击和抗菌药物的杀灭，而一旦条件合适，细菌生物膜就可发生播散，导致慢性感染或感染复发，给临床治疗带来了极大困难[4-5]。

抗菌药物通过全身性使用会导致耐药菌和药物不良反应的出现[6]。有文献报道通过广谱抗菌药物涂抹生物材料来防止细菌的黏附、定植和生物膜形成[7]。对于短期尿道插管，已有呋喃西林或银合金浸渍导管控制尿路感染的相关报道。β-内酰胺类抗菌药物头孢他啶(ceftazidime，CAZ)在体外可以显著抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成[8]，然而关于体内研究目前尚无相关报道。因此，本研究以雌性C57BL/6系小鼠为动物模型，考察CAZ纳米粒包被导管对铜绿假单胞菌引起的CAUTI的影响，为临床治疗CAUTI提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验菌株及动物来源 铜绿假单胞菌PAO1保存于陆军军医大学西南医院药理基地。C57BL/6系雌性小鼠，6～8周龄，体质量20 g左右，来自陆军军医大学动物中心。

1.2主要试剂及设备 CAZ(中国食品药品检定研究院)，MH琼脂(英国Oxoid公司)，LB培养基(青岛海博生物技术有限公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA，50∶50)、脱氧胆酸钠(美国Sigma公司)，15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯 (HS15，德国BASF公司)，医用级硅胶导管(型号SIL025，美国Braintree Scientific公司)，PE-10聚乙烯管(美国BD公司)，高效液相色谱仪(HPLC，美国Waters公司)，超声波破碎仪(美国Sonics公司)。

1.3方法

1.3.1CAZ纳米粒的制备及浓度测定 将20 mg PLGA溶于1 mL氯仿中，将2 mg CAZ、0.5%脱氧胆酸钠和0.5% HS15溶于10 mL超纯水中，将有机相加入水相中，探头超声搅拌10 min，功率45%，超声间隔每次5 s，于旋转蒸发仪上旋转蒸发除去有机溶剂，溶液由白色乳状液变为带有乳光的澄清溶液即得CAZ纳米粒。采用HPLC测定CAZ在PLGA纳米粒中的含量。取制备好的纳米粒溶液100 μL，加入900 μL 乙腈溶液破乳，混合均匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。色谱条件：色谱柱为Diamonsil 反相C18柱(250.0 mm×4.6 mm×5.0 μm)，流动相为乙腈-含0.05 mol/L 磷酸二氢钾缓冲盐溶液(pH=2.5，体积比10.4∶89.6)，流速为1.2 mL/min，检测波长为254 nm，柱温30 ℃，进样体积为20 μL。另取100 μL纳米粒溶液称质量，计算载药量。纳米粒载药量=包裹在纳米粒中的药物含量/称取的纳米粒质量×100%。

1.3.2CAZ纳米粒包被导管及表面药物含量测定 将无菌的4～6 mm硅胶导管浸入载有CAZ的PLGA纳米粒溶液中，浸泡1 h后取出，于37 ℃干燥过夜。为获得均匀致密的涂层，重复此过程 3次。上述过程均在无菌层流条件下完成。之后将导管用去离子水冲洗后于室温干燥至少2 h，备用。 取1 cm CAZ纳米粒包被导管浸入含有2 mL乙腈的烧杯中，破乳使药物释放出来。将导管置于乙腈溶液中室温放置24 h。之后将导管取出放入新鲜的乙腈溶液中，使药物继续释放。重复该过程3次，确保药物释放完全。合并3次的药物溶液，取1 mL过滤进行HPLC分析，测定药物总量。

1.3.3CAZ纳米粒包被导管的体外释药率 取 3 段1 cm CAZ纳米粒包被导管分别置于含有20 mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)的离心管中，将离心管置于恒温摇床中，每天自离心管中取出 4 mL 液体,共取7 d， 用HPLC测定溶液中CAZ含量，同时立即向离心管中补加4 mL同温度的新鲜介质，由标准曲线计算溶液中CAZ的浓度及累计释放率。取3份样本的平均值绘制导管表面CAZ的累积释放曲线图。体外CAZ释放率=释放介质中 CAZ含量/导管上CAZ总量。

1.3.4CAZ纳米粒包被导管的体外抑菌活性 挑取铜绿假单胞菌PAO1单菌落接种于LB肉汤中，37 ℃、180 r/min振荡培养过夜。 用无菌生理盐水稀释菌液至0.5×108CFU/mL，然后用无菌棉签蘸取菌液涂布在MH琼脂平板上。使用无菌镊子分别将1 cm不含有CAZ的导管和1 cm CAZ纳米粒包被尿管轻轻放置在MH琼脂板上，37 ℃培养24 h。通过测量和记录导管周围的抑菌圈评估其抗菌活性。然后将导管取出并转移至新鲜的MH琼脂平板，确保导管的同一侧与琼脂接触， 重复如此操作至第7天，记录每天抑菌圈大小。

1.3.5小鼠CAUTI模型的建立 (1)菌液制备：将无菌导管放入24孔板中，铜绿假单胞菌PAO1过夜培养物用LB 稀释1 000倍，然后取1 mL稀释菌液加入24孔板中，37 ℃培养24 h。将导管表面的生物膜洗脱下来，稀释至1×108CFU/mL用于体内试验。(2)感染模型建立：4～6 mm长的硅胶导管安装在6～8 mm长的PE-10聚乙烯管上，后者再连接到鲁尔接头适配器上。 整个装配浸泡在70%乙醇中，空气干燥后用紫外线消毒约2 h。每只小鼠尿道区域用75%乙醇擦拭，膀胱排空尿液。将带有硅胶导管和PE-10聚乙烯管的适配器轻轻地插入小鼠的尿道口。PE-10聚乙烯管用镊子轻轻推进。硅胶导管被释放到膀胱中，小心取出带有PE-10聚乙烯管的适配器，从而将硅胶管留在膀胱中。在膀胱内植入硅胶导管后，将50 μL PBS或铜绿假单胞菌PAO1菌液经尿道导管接种到膀胱中。实验分组：空白对照组，小鼠体内植入未包被的导管；CAZ处理组：小鼠体内植入CAZ纳米粒包被导管。所有小鼠在感染后的指定时间脱颈处死。每组每天处死5只小鼠，试验重复3次。

1.3.6膀胱组织和导管表面细菌菌落计数 经下腹部正中线切口迅速取出膀胱，称质量，加入1 mL生理盐水，用研磨器研磨成匀浆。导管取出后放入装有1 mL生理盐水的离心管中，超声处理15～20 min，然后涡旋混匀。用生理盐水按照10倍浓度梯度将组织或导管进行稀释，取每个浓度稀释液1 mL分装于无菌培养皿中，再加入9 mL无菌的LB固体培养基混匀，37 ℃培养过夜。采用平板菌落计数法进行细菌计数。

1.3.7膀胱组织病理观察[苏木素-伊红(HE)染色] 首先使用梯度乙醇为膀胱组织脱水，每次30 min。脱水完成后， 用二甲苯透明；将已经透明后的组织块置于已经融化的石蜡中，放入溶蜡箱保温，待石蜡完全浸入组织后进行包埋；将包埋好的石蜡块固定于切片机上，切成5～8 μm厚的薄片。切下的薄片往往皱褶，需放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45 ℃恒温箱中烘干；用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经梯度乙醇脱水，最后入蒸馏水，就可行HE染色；染色后的切片经100%乙醇脱水，再经二甲苯透明，树胶封片，盖上盖玻片，贴标签，在光学显微镜下进行观察。

1.3.8细胞因子定量免疫分析 采用ELISA试剂盒对小鼠膀胱组织匀浆上清液白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-10细胞因子进行定量检测，实验重复3次。

2 结 果

2.1CAZ纳米粒载药量及导管表面药物总量的测定 经HPLC测定，载CAZ的PLGA纳米粒载药量为(6.56±1.24)%，每1厘米导管表面所含药物总量为(10.48±0.04)μg。

2.2CAZ纳米粒包被导管的体外释药率 结果显示，7 d内导管表面CAZ累积释放量为71.34%。其中前4 d释放速度较快，累积释放量达到64.46%，见图1。

图1 CAZ纳米粒包被导管的体外药物累积释放量

2.3CAZ纳米粒包被导管的体外抑菌活性检测 未包被导管7 d内均无抑菌圈出现，而CAZ纳米粒包被导管周围抑菌圈大小在(17.7±2.2)～(28.2±3.3) mm，表明CAZ纳米粒包被导管具有较好的抗菌作用，见图2。

图2 CAZ纳米粒包被导管对铜绿假单胞菌的抗菌活性

2.4膀胱组织和导管表面细菌菌落计数 采用菌落平板计数法对小鼠的膀胱组织和导管表面进行细菌学分析，空白对照组小鼠膀胱组织平均细菌量增加，从感染后第1天的3.8 logCFU/g到第7天的7.1 logCFU/g；然而CAZ处理组在感染后第1～4天小鼠膀胱组织细菌平均值小于1.0 logCFU/g，第7天未检测到细菌(图3A)。空白对照组导管表面细菌数从第1天的4.9 logCFU/植入物增加到第7天的6.5 logCFU/植入物；相反，CAZ的存在限制了细菌在植入物表面上的定植，第1～7天导管表面的细菌数均小于1.0 logCFU /植入物(图3B)。

A：膀胱组织；B：导管表面；a:P<0.01,与空白对照组比较

图3小鼠膀胱组织和植入物表面细菌菌落计数结果

2.5小鼠膀胱组织病理观察结果 在感染后第1天，空白对照组小鼠膀胱组织有上皮细胞脱落，且伴有中性粒细胞浸润(图4A)，而CAZ处理组小鼠膀胱表现出上皮细胞有部分脱落，出现轻微炎症(图4B)。7 d后，空白对照组小鼠膀胱有大量上皮细胞脱落、坏死，并伴有中性粒细胞浸润，存在水肿(图4C)，但是CAZ处理组膀胱炎症细胞部分增加，膀胱组织比较完整，没有明显的炎症信号(图4D)。

2.6细胞因子水平定量免疫分析 空白对照组小鼠膀胱组织促炎性细胞因子IL-6和TNF-α水平随感染后天数增加而升高，且CAZ处理组两种细胞因子水平显著低于空白对照组(P<0.01)。然而，空白对照组抗炎性细胞因子IL-10水平虽然随感染后天数增加而升高，但CAZ处理组IL-10水平显著高于空白对照组(P<0.01)，见图5。

A:空白组感染第1天；B：CAZ处理组感染第1天；C：空白组感染后第7天；D：CAZ组感染第7天

图4小鼠膀胱组织石蜡切片HE染色(×100)

A：IL-6；B：TNF-α;C：IL-10；a：P<0.01,与空白对照组比较

图5小鼠膀胱IL-6、TNF-α和IL-10细胞因子水平测定

3 讨 论

尿路感染(UTI)是医院获得性感染最常见的类型之一，约80%院内尿路感染与尿道插管有关，尿道导管内缺乏免疫，益于细菌定值，为尿路致病菌进入膀胱创造了条件[9-10]。由于铜绿假单胞菌能够在尿道导管表面形成难以清除的生物膜，因此铜绿假单胞菌介导的CAUTI的发病机制非常复杂。本研究中的药物释放数据显示CAZ纳米粒包被导管能够持续释放药物，且释放浓度高于其最小抑菌浓度(MIC)，可有效预防CAUTI，而且即使药物以亚MIC浓度释放时也可避免耐药的发生。体外抑菌活性检测结果显示CAZ可以保持较强的抗菌活性，表明导管表面的药物可以持续释放。这与其他抗菌药物涂抹导管的抗菌作用相似[11]。

膀胱组织中的细菌数量与所有时间点取出的植入物表面的细菌量相关。有研究报道肠球菌感染小鼠膀胱炎模型中，膀胱植入尿道导管7 d后其膀胱和肾脏中细菌数增加及植入物表面生物膜形成增加[12]，这与本研究结果一致。此外，有文献报道兔子CAUTI模型中羟磷灰石纳米粒包被导管表面生物膜形成较未包被导管减少和尿路上皮组织无明显病理特征[13]。本研究也发现CAZ纳米粒包被导管后其更能抵抗细菌定植和生物膜形成。病理切片结果显示CAZ纳米粒包被植入物几乎不影响膀胱组织病理，其异物介导的轻微炎症归因于宿主的免疫反应，它能够克服未包被植入物引起的严重炎症，并不出现水肿、淋巴细胞增多等症状。提示CAZ纳米粒包被导管在预防和治疗铜绿假单胞菌引起的CAUTI方面具有一定的临床疗效。

宿主对铜绿假单胞菌引起的尿路感染的有效防御主要取决于非特异性抗菌防御机制[14]。TNF-α 和 IL-6 是重要的炎症介质，具有调节免疫应答，在机体的抗感染中参与免疫反应，是引起免疫细胞发生功能紊乱的重要促发因子，最终可导致重要器官的衰竭。IL-10是一种具有抗炎、抗免疫和抗纤维化作用的免疫抑制性因子，通过抑制Th1细胞的增殖而发挥其抗炎作用。有研究报道在粪肠球菌感染的小鼠CAUTI模型中，膀胱植入导管后IL-1β、IL-6、IL-12和IL-17炎症因子表达均上调[15]。本研究膀胱组织中细胞因子水平检测结果显示植入CAZ纳米粒包被导管后降低了植入物介导的炎症作用，提示CAZ纳米粒包被导管提高了宿主对感染的免疫反应。总之，本研究显示CAZ纳米粒包被导管可以在体内释放有效的药物浓度而防止铜绿假单胞菌的黏附和生物膜形成，因此为临床医生有效控制铜绿假单胞菌引起的CAUTI带来了希望，同时也为抗菌药物纳米粒包被导管治疗其他尿路致病菌引起的各种疾病提供了参考依据。