基于模块化优化策略强化大肠杆菌合成血红素

翁焕娇 ， 丁雯雯 ， 石雅南 ， 李江华 *， 康 振

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

血红素是一种存在于生物体内的含铁卟啉衍生物，由原卟啉与1个二价铁原子构成[1]。其核心是亚铁离子，具有携氧能力，是有氧呼吸及厌氧呼吸电子传递链蛋白质的重要组分，参与生物细胞中的多种氧化代谢，包括氧气运输、氧化应激反应和依赖于电子传递的氧化磷酸化等；除此之外，它还参与其他双原子气体的合成，例如一氧化碳和一氧化氮[2-3]。作为一个调节因子，血红素通过在转录水平、翻译水平、蛋白质靶定、蛋白质稳定性和分化等方面介导基因的表达[4-12]。目前，血红素不仅在食品行业常被用于着色剂，如肠类制品；在医学临床上也广泛的使用，如作为半合成胆红素原料，生产抗肝功能亢进、抗炎症作用和抗肿瘤作用的重要药物等。此外，血红素也是良好的补血剂，亚铁血红素可直接被人体吸收，吸收率高达10%~20%[13-16]。

包括血红素在内的卟啉类化合物的合成可以通过化学合成，但是由于它们结构复杂，合成过程中反应步骤繁琐，得率比较低，使得卟啉类化合物价格昂贵[17]。为此，微生物成为生产结构复杂的卟啉类化合物的最佳选择。随着基因工程技术的成熟，选择大肠杆菌作为宿主大量合成血红素具有广阔的前景[1，18]。

在生物体内，血红素的合成需要经过多步酶促反应，且途径中涉及到的酶大部分都是高度保守的[2]。 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是合成血红素的关键前体物质[19]。如图1（a）所示，两分子ALA在依赖于Zn2+的ALA脱水酶（HemB，由基因hemB编码）催化下缩合生成胆色素原，然后4分子胆色素原在羟甲基胆素合成酶（HemC，由基因hemC编码）的作用下进一步缩合生成不稳定的羟甲基胆素，接着在尿卟啉原Ⅲ合成酶（HemD，由基因hemD编码）的环化作用下生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ，再经过尿卟啉原Ⅲ脱羧酶（HemE，由基因hemE编码）的作用，将尿卟啉原Ⅲ的4个侧链脱羧化形成甲基，生成粪卟啉原Ⅲ；粪卟啉原Ⅲ在粪卟啉原Ⅲ氧化酶（HemF，由基因hemF编码）的催化作用生成原卟啉原Ⅸ，同时释放H2O2和CO2。在原卟啉原氧化酶（HemG，由基因hemG编码）催化下去除原卟啉原Ⅸ的6个氢原子生成原卟啉Ⅸ。最后亚铁螯合酶（HemH，由基因hemH编码）通过在原卟啉Ⅸ的内部螯合铁离子形成血红素，从而完成整个血红素合成途径。

图1 大肠杆菌中血红素合成途径及途径基因分模块组合方式示意图Fig.1 Heme biosynthesis pathway in E.coli and the modular assembling ways of genes

在大肠杆菌中，ALA的合成受血红素的严格反馈调控[20]。张俊丽等发现，过量表达血红素合成途径基因hemD、hemF有利于ALA的积累[21]。Kwon等成功在大肠杆菌中表达来源于类球红细菌的hemA基因，合成血红素[22]。此外，通过异源表达泛酸途径的coaA基因和卟啉合成途径的hemB、hemC、hemD、hemE基因，也可获得高产血红素的菌株，但是这个产量对于工业生产来讲，还是较低[23]。因此，进一步对血红素合成途径进行改造，提高血红素产量是十分必要的。

微生物代谢网络往往复杂且多变，通过引入模块化组合策略能很好地解决代谢途径中代谢流量的平衡问题，提高产量和转化率[24]。由于血红素合成途径调控机理复杂，受多方面因素影响[25-26]。为了进一步促进血红素的积累，本研究将ALA C5合成途径关键酶基因hemL和hemA划分为第一模块，用高拷贝质粒pUC19过量表达，同时将来源于大肠杆菌血红素生物合成途径的基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH分为第二、第三模块，其中基因hemB、hemC、hemD、hemE为第二模块，基因hemF、hemG、hemH为第三模块，利用拷贝数不同的质粒改变第二、第三模块中基因的表达强度，对这2个模块的基因组合表达，得到的重组菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7，在 250 mL 的摇瓶发酵48 h 时，其血红素产量分别为 0.08、0.09、0.25、0.35、0.44、0.56、 0.46 μmol/（L·OD）。 将摇瓶水平上血红素产量最高的重组菌株E.coli-D6在3 L发酵罐中进行放大培养，48 h 时产量达到 0.954 μmol/（L·OD）。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 菌株E.coliJM109，用于重组质粒的构建；E.coliDH5α，作为宿主细胞，用于重组质粒的表达。相关质粒和菌株见表1。

表1 菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 主要试剂和工具酶 质粒小量提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、抗生素包括氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、氯霉素和链霉素等、IPTG等，均购于生工生物工程（上海）股份有限公司；胶回收试剂盒和各种限制性内切酶等，购自Thermo公司；Primer Star Max DNA聚合酶、DNA连接酶、感受态细胞制备试剂盒，购于宝生物工程（大连）有限公司；5-氨基乙酰丙酸和胆色素原，购于Sigma-Aldrich公司；胰蛋白胨、酵母提取物，购于Oxoid公司；其他化学试剂，均购于上海国药集团，纯度为分析纯。

1.1.3 培养基 LB培养基（g/L）：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉 5.0，pH 7.0；装液量 8 mL/dL；

发酵培养基 （g/L）：（NH4）2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 15，MgSO4·7H2O 1.0， 酵母提取物1.0，葡萄糖 20；pH 7.0，装液量 30 mL/250 mL。

分批发酵培养基 （g/L）：（NH4）2SO415，KH2PO45.0，Na2HPO4·12H2O 15，MgSO4·7H2O 1.0，酵母撮物1.0，葡萄糖 35；pH 7.0，装液量 1.5 L/3 L。

固体培养基是在此基础上添加2.0 g/L琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 血红素合成途径2个模块的相关表达载体构建 以E.coliDH5α基因组为模板分别扩增hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH基因，然后以融合PCR将hemC和hemD片段融合为hemC-hemD，将hemG和hemH片段融合为hemG-hemH。引物表2所示。

表2 引物Table 2 Primers used in this study

利用酶切位点PstⅠ和HindⅢ将片段hemC-hemD分别与表达载体pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2连接，获得重组载体pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD。通过BamHⅠ和SacⅠ将片段hemB分别与载体pRSFDuet-2-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemC-hemD连接，得到重组载体pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD。将扩增得到的hemE片段通过酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ分别连接到pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD中，得到重组质粒pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE、pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE。

利用酶切位点BamHⅠ和HindⅢ将从大肠杆菌基因组扩增得到的片段hemF分别与表达载体pRSFDuet-2、pCDFDuet-2、pACYCDuet-2 连接，获得重组载体pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF。通过NdeⅠ和XhoⅠ将片段hemG-hemH分别与载体pRSFDuet-2-hemF、pCDFDuet-2-hemF、pACYCDuet-2-hemF连接，得到重组载体pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH、pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH。

1.2.2 大肠杆菌合成血红素相关重组工程菌株的构建 将本实验室保藏的质粒pUC19-hemA-hemL转化菌株E.coliDH5α，得到重组菌株E.coliDH5α：pUC19-hemA-hemL。将大肠杆菌血红素合成途径两个模块的相关重组质粒两两组合，转化菌株E.coliDH5α：：pUC19-hemA-hemL， 得到重组工程菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7：

E.coli-D1：pUC19-hemA-hemL；

E.coli-D2：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D3：pUC19-hemA-hemL+pRSFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D4：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D5：pUC19-hemA-hemL+pCDFDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pACYCDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D6：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH；

E.coli-D7：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pCDFDuet-2-hemF-hemG-hemH。

1.2.3 菌株培养条件

1）摇瓶培养。挑取在斜面培养基中培养的重组菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7， 接种于LB培养基，37℃过夜培养约12 h后，以体积分数1%接种量转接发酵培养基中发酵，0 h时添加0.1 mmol/L IPTG诱导基因表达以及对应的抗生素，氨苄青霉素（100μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）、链霉素（50 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL），37 ℃，220 r/min 培养，4 h 时添加 100 μmol/L 的 FeSO4，周期 48 h。

2）分批培养。挑选已在平板上活化的重组菌株E.coli-D6，接种于LB培养基，37℃过夜培养约12 h后，以体积分数2%接种量转接到装有1.5 L发酵培养基的3 L发酵罐中培养，0 h时添加0.1 mmol/L IPTG诱导基因表达以及对应的抗生素，氨苄青 霉素 （100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL），37 ℃，400 r/min 培养，4 h 时添加100 μmol/L的FeSO4，通过流加 4 mol/L的 NaOH 将发酵液的pH控制在6.5左右，发酵周期48 h。

1.2.4 分析方法

1）OD600测定。取适量发酵液于 EP管中，12000 r/min离心3 min，弃上清液，用等体积去离子水重悬菌体；重悬液经适当稀释后，以去离子水为空白对照，在紫外分光光度计600 nm波长下，测定细胞浓度。

2）葡萄糖质量浓度测定。取适量发酵液于EP管中，12000 r/min离心3 min，以适当的倍数稀释发酵液上清液，用SBA-40C生物传感分析仪（山东省科学院）检测葡萄糖质量浓度。

3）ALA质量浓度测定。ALA质量浓度测定采用Mauzerall和Granick的分光光度法[27]：取适量发酵液于EP管中，12000 r/min离心3 min，以适当的倍数稀释发酵液上清液。取稀释液300 μL，分别加入400 μL的乙酸钠缓冲液（称取82 g无水乙酸钠，加入57 mL冰醋酸，并用去离子水定容至1 L）和35 μL的乙酰丙酮，混合均匀后煮沸反应10 min。冷却至室温，再加入 Modified Ehrlich’s reagent试剂（称取1 g对二甲氨基苯甲醛，加入体积分数70%高氯酸8 mL，并用冰醋酸定容至50 mL）反应10 min，在紫外分光光度计556 nm波长下，测定吸光值，然后根据不同浓度的ALA标准样品在556 nm波长下的吸光值计算出样品ALA的质量浓度。

4）胆色素原质量浓度测定[27]。取等OD发酵液于EP管中，4℃，12000 r/min离心5 min，弃上清液；用0.25 mol/L的磷酸氢二钠缓冲液（称取6.703 g磷酸氢二钠，溶于100 mL去离子水中，并用0.25 mol/L的柠檬酸溶液调节pH至6.65）清洗2次菌体后重悬菌体，并使用超声破碎仪破碎细胞；将细胞裂解液在4℃、12000 r/min条件下离心5 min，取裂解液上清液500 μL，加入等体积的The regular Ehrlich’s reagent试剂 （称取2 g对二甲氨基苯甲醛，溶于100 mL浓盐酸），室温反应5 min后在紫外分光光度计554 nm波长下测定吸光值，然后根据不同浓度的胆色素原标准样品在554 nm波长下的吸光值计算出样品中胆色素原的质量浓度。

5）血红素质量浓度测定。血红素质量浓度的测定采用荧光法[28]：取适量发酵液于EP管中，12000 r/min离心3 min，弃上清液，用等体积去离子水重悬菌体，测定其OD600；准备2个相同的1.5 mL EP管（其中一个作为对照实验），分别加入0.1 OD的细胞重悬液，同时加入200 mmol/L草酸溶液，将其总体积补足至500 μL，然后加入2 mol/L草酸溶液500 μL，混合均匀后迅速在100℃条件下反应30 min，对照组放置在室温条件下。待样品自然冷却后在12000 r/min条件下离心5 min，取200 μL上清液于黑色96孔板中，在酶标仪中测定样品和对照组的荧光值，其中血红素荧光测定的激发波长为400 nm，发射波长为620 nm。根据不同浓度血红蛋白标准样品的荧光值计算出样品中血红素的质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 血红素合成途径分析与模块化构建

在微生物代谢和工业生物技术中，如何找到一种高效的方法解决微生物代谢途径中代谢流的平衡已成为一个难题。传统的理性设计策略往往不能对细胞代谢有一个整体把握；而组合方法虽然覆盖面较广，但是需要进行高通量筛选。对此，Bradley等[24]提出一个多模块代谢工程改造理论（multivariate modular metabolic engineering，MMME），将代谢途径中的关键酶分为特定的模块，同时通过控制不同模块的表达水平来平衡代谢途径中的代谢流。由于MMME方法简单，应用广泛，已逐渐成为代谢工程和工业生物技术领域中重要的改造手段。

根据Gunhild等[29]对血红素合成途径中酶分子结构和功能的分析，血红素合成途径中的中间产物不稳定，所有的卟啉原类物质会快速氧化成相关的卟啉类物质，因此可以推测血红素合成途径中的酶分子之间可能存在相关作用。例如，为了避免尿卟啉原Ⅰ的积累，HemC和HemD可能会形成一个蛋白复合体，而且在细菌中，编码HemC和HemD的基因是由同一个操纵子操控的；在HemH作用下将铁离子螯合进原卟啉Ⅸ内部的这个过程中需要HemG的参与[30]，因此推测HemG和HemH之间会形成一个蛋白复合体，根据文献报道，已经在蓝细菌中验证HemG与HemH的蛋白复合体的存在[31]。在本研究中为了保证血红素合成的前体物质ALA的质量浓度，将ALA合成的关键基因hemAs和hemL划分为第一模块，用pUC19质粒过量表达；为了优化大肠杆菌中血红素合成途径的相关基因hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH，将 这7 个基因分为 2 个模块，hemB、hemC、hemD、hemE基因为第二模块，hemF、hemG、hemH为第三模块，并使用3个兼容质粒pRSFDuet-2（高拷贝质粒）、pCDFDuet-2（中低拷贝质粒）和 pACYCDuet-2（低拷贝质粒），对第二、第三模块中的基因进行组装优化表达（图1），考察其对血红素产量的影响。

以E.coliDH5α基因组为模板分别扩增hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH基因，同时将片段hemC、hemD融合为hemC-hemD，片段hemG、hemH融合成hemG-hemH，得到基因片段凝胶电泳图如图2所示。将上述各基因片段连接到TVector pMD19（Simple）上，测序正确后，将质粒双酶切，得到的各重组基因片段与经过相同酶切位点处理后的表达载体连接，构建一系列重组载体。

2.2 血红素合成途径优化与血红素的强化

将构建好的重组载体两两组合，转入含有pUC19-hemAs-hemL质粒的大肠杆菌DH5α中，得到重组菌株E.coli-D1、E.coli-D2、E.coli-D3、E.coli-D4、E.coli-D5、E.coli-D6、E.coli-D7，进行摇瓶发酵培养，在培养4 h后添加100 μmol/L Fe2+，测定菌体生长情况、ALA积累量、胆色素原质量浓度和血红素产量。如图3所示，血红素产量越高，重组菌的发酵液颜色越红；其中，重组菌E.coli-D2用高拷贝质粒表达第二模块的基因，用中低拷贝质粒表达第三模块的基因时，其生物量远低于其他菌株，可能是由于基因hemG的产物原卟啉Ⅸ的过量积累对细胞具有毒害作用[32]；而且过量表达ALA下游途径的基因后，ALA产量与重组菌E.coli-D1（没有过量表达ALA下游途径基因）相比，明显下降；同时检测了表达基因hemB后的产物PBG，发现各重组菌株的PBG产量没有明显差异，推测可能是HemB蛋白比较稳定，并不是血红素合成途径中的限速酶；另外，从图3（e）中可以看出，用中低拷贝质粒表达第二模块的基因，血红素产量较高，其中6号菌株用低拷贝质粒表达第二模块的基因，用高拷贝表达第三模块的基因，其血红素产量最高，达到0.56 μmol/（L·OD）。

图3 血红素合成途径基因分模块表达对细胞生长代谢的影响Fig.3 Effect of expression of genes in heme biosynthesis pathway on cell metabolism

2.3 血红素分批发酵

选择摇瓶发酵培养中血红素产量最高的重组菌株E.coli-D6，进一步验证其合成血红素的能力，将E.coli-D6在3 L发酵罐中进行放大培养，同样在培养4 h后添加100 μmol/L Fe2+，发酵过程参数变化如图4所示。

图4 重组菌株E.coli-D6在3 L发酵罐中分批培养合成血红素Fig.4 Batch fermentation of heme by the recombinant strain E.coli-6 in a 3 L fermentor

从图4可以看出，12 h后葡萄糖开始大量被消耗，重组菌株开始大量积累ALA，40 h左右ALA产量最高，达到3865 mg/L，随着血红素在菌体生长后期的积累，ALA开始消耗，产量慢慢下降，在48 h发酵结束时，ALA产量剩余2789 mg/L；28 h后，重组菌株开始大量合成血红素，在发酵48 h时，此时葡萄糖几乎完全耗尽，血红素产量最高，达到0.954 μmol/（L·OD），与摇瓶水平上血红素的产量相比，提高了约70%。在整个发酵过程中，ALA大量积累，虽然后期随着血红素的积累，ALA开始消耗，但是明显从ALA到血红素的转化率仍然很低。血红素的合成途径中存在其他竞争的分支途径，研究表明，HMB自发环化形成粪卟啉原Ⅰ以及原卟啉到血红素的转化率低是血红素合成过程中的限速步骤[1]。如何进一步提高ALA到血红素的转化率可作为下一步研究的重点。

3 结 语

血红素合成途径复杂且受严格调控，目前关于血红素合成方面的研究比较少。本研究通过将来源大肠杆菌的血红素合成途径基因分成2个模块，利用拷贝数不同的质粒，将2个模块随机组合，在过量表达谷氨酰-tRNA还原酶（hemA编码）、谷氨醛氨基转移酶（hemL编码）的基础上，强化了血红素合成途径。本研究构建的重组大肠杆菌工程菌E.coli-D6：pUC19-hemA-hemL+pACYCDuet-2-hemB-hemC-hemD-hemE+pRSFDuet-2-hemF-hemG-hemH摇瓶发酵培养48 h，生产血红素0.56 μmol/（L·OD）。 在 3 L 发酵罐中进行分批培养，其血红素浓度达到 0.954 μmol/（L·OD）， 比摇瓶上提高了70%。采用代谢工程策略，改造微生物菌株来合成目的产物血红素，有效提高了血红素产量。