瓦布贝母内生真菌WBS020多糖理化性质和抗氧化活性

潘 峰， 张慧慧， 许晓燕， 杨玉霞， 吴 卫*

（1.四川农业大学 农学院，四川 成都 611130；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610041）

多糖是一类由十个或十个以上单糖组成的聚合物，目前在食品、医药和材料等方面有着重要应用。微生物作为多糖来源的最主要资源之一越来越受到人们的重视。从真菌中提取分离到的多糖表现出良好的抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗菌消炎、抗衰老等多种生理活性[1-3]。内生真菌作为一类重要的真菌资源，已有研究表明其不仅能够产生活性多样的小分子化合物[4]，还可产生大量的大分子多糖类物质[5-7]。然而相对于内生真菌小分子天然产物而言，关于内生真菌的多糖研究明显偏少。

瓦布贝母（Fritillariaunibracteatavar.wabuensis）是百合科贝母属川贝母的栽培品种，为名贵中药川贝的基源种[8]。近年来，实践证明瓦布贝母较暗紫贝母等品种更能适应环境变化，形态也较大[9]。本课题组曾从瓦布贝母新鲜鳞茎中分离到多株内生真菌，对其研究后发现部分内生真菌可产生物碱类活性成分[10-11]，作者还发现瓦布贝母内生真菌WBS020发酵液具有良好的抗氧化活性，但其多糖成分尚未进行研究。为此，本研究提取菌株WBS020发酵液胞外多糖，对其进行了分离纯化并对部分理化结构信息初步研究，考察其抗氧化活性，以期对瓦布贝母内生真菌多糖的开发利用奠定基础，也为其他药用植物内生真菌多糖研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

内生真菌WBS020为分离自瓦布贝母的优势菌株，并且由四川农业大学吴卫教授用分子生物学方法鉴定为Fusarium tricinctum（Accession No.KU350730）。

1.2 试剂

DEAE-纤维素（type DE52），购于 Whatman 公司；Sephadex G-150，购于 Pharmacia 公司；S-8 型和D101 resin大孔吸附树脂，购于广州翔博生物科技有限公司。不同相对分子质量的T-系列葡聚糖（T-5、T-10、T-40、T-70、T-500）、 甘 露糖 （D-（+）-mannose）、鼠李糖（L-rhamnose monohydrate）、半乳糖醛酸（D-（+）-galacturonic acid）、葡萄糖（D-（+）-glucose）、半乳糖（D-（+）-galactose）、木糖（D-（+）-xylose）、阿拉伯糖（L-（+）-arabinose）、岩藻糖（L-（-）-fucose）、DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）和 ABTS （2，2-Azino-bis （3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic）acid），购于上海 Sigma-Aldrich公司。氧化氘（D2O，99.9 atom%D），购于上海麦克林生化科技有限公司；（色谱级）乙腈，购于飞世尔实验器材（上海）有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器设备

SW-CJ-1F型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；HY-150s型生物摇床，武汉汇诚生物科技公司产品；RE-2000型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂制造；SJIA-10N型普通多歧管冷冻干燥机，宁波市鄞州双嘉仪器有限公司产品；自动馏分收集器，美国Bio-Rad公司产品；Waters 1525 HPLC系统，美国Waters公司产品；ELSD检测器，美国Alltech公司产品；岛津UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司产品；安捷伦 1100高效液相色谱仪 （HPLC），美国 Agilent公司产品；TSK-GEL G5000PWXL凝胶注 （7.8 mm×30 cm），日本TOSOH 公司产品；Phenomenex Luna 5u C18（2） 100 Å 柱 （250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm）， 丹 麦Phenomenex公司产品；傅里叶变化红外光谱仪，美国Perkin Elmer公司产品；酶标仪（Multiskan GO），美国Thermo Scientific公司产品；MD34型透析袋（截留量3500），美国联合碳化公司产品。

1.4 供试菌株发酵及粗多糖提取

取保存的菌种于新鲜PDA培养基上活化，将新长出的菌丝接种到PDB液体培养基上，按照Pan所描述的培养方法制备种子液和发酵[11]。采用抽滤方法分离菌丝体和发酵液，收集发酵液，在50～60℃条件下利用旋转蒸发仪减压浓缩到原体积的20%。之后用石油醚（30～60℃），乙酸乙酯和正丁醇依次分别重复2～3次等体积萃取浓缩液，进行初步脱脂，除色素等。然后加入其体积4倍的无水乙醇，在4℃冰箱静置过夜。除去上层澄清液之后，4000 r/min离心30 min并收集沉淀，用无水乙醇清洗。水浴去除乙醇后将所得粗多糖在冷冻干燥机冻干备用。

1.5 粗多糖除杂

1.5.1 粗多糖除色素 称取适量粗多糖复溶于50 mL蒸馏水中，然后参考Liu的方法选用S-8和D101 2种大孔吸附树脂进行脱色素[12-13]。即首先将预处理好的S-8大孔吸附树脂用湿法装柱的方法制备大孔吸附树脂色谱柱（3.0 cm×40 cm），将50 mL粗多糖溶液以1.0 mL/min流速采用动态吸附法过S-8树脂色谱柱，再用25 mL蒸馏水冲洗色谱柱，收集洗脱液，选取新的S-8树脂色谱柱重复上述过程一次。将吸附过的多糖溶液再次浓缩到约50 mL，再以同样的方法和过程用D101大孔吸附树脂色谱柱进行脱色素。收集多糖溶液并冷冻干燥备用。

1.5.2 粗多糖除蛋白质 采用蛋白酶和Sevag试剂联用的方法清除多糖溶液中的蛋白质成分[14]。首先将多糖溶于50 mmol/L磷酸钠缓冲液（PBS，pH 7.4）中，使溶液质量浓度约为100 mg/mL。再加入胰蛋白酶适量使得溶液中其终浓度为5 U/mL，在37℃水浴3 h，随后4000 r/min离心10 min，由于多糖溶解于水层，收集上清液。在55℃预热的上清液中加入木瓜蛋白酶（终浓度为5 U/mL），并在此温度下水浴3 h，且4000 r/min离心10 min，收集上清液。最后选用Sevag试剂法除蛋白质，重复3～5次。4000 r/min离心后收集下清液备用。

1.5.3 粗多糖除小分子物质 将除色素和蛋白质的多糖溶液置于分子截留量为3500的透析袋中，于蒸馏水中进行透析。每12 h更换一次蒸馏水，共透析48 h，以除去盐离子，小分子物质等。完成透析后冻干备用。

1.6 多糖分离

多糖分离纯化选用纤维素DEAE-52色谱和sephadex G-150色谱进行。将纤维素DEAE-52按照说明书处理后，采用湿法装柱（31.2 mm×195 mm），然后用去离子水在0.6 mL/min条件下平衡色谱柱10 h左右，加入多糖样品，分别用去离子水、0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L 的 NaCl溶液以 0.5 mL/min 流速梯度洗脱，10 mL每管收集洗脱液。用苯酚-浓硫酸法检测，并绘制纤维素DEAE-52洗脱曲线，得到5个洗脱峰，其中以蒸馏水洗脱得到的峰为主峰。收集主峰，浓缩，得中性多糖备用。将sephadex G-150按照说明书预处理后，按照纤维素DEAE-52相同方法装柱、平衡。上样后用0.5 mL/min流速以去离子水冲洗，10 mL每管收集洗脱液，用苯酚-浓硫酸法检测，并绘制洗脱曲线，得到2个洗脱峰，将其中的主峰命名为WBS020EPS1-2。收集冷冻干燥备用。

1.7 纯度和平均相对分子质量测定

纯度和平均相对分子质量测定采用高效液相凝胶渗透色谱蒸发光散射检测器法 （Highperformance gel -permeation chromatography combined with evaporative light scattering detector，HPGPC-ELSD）色谱法，参考Liu所述步骤[15]，并略做修改。具体为，选用Waters 1525 HPLC高效液相色谱系统；TSK-GEL G5000PWXL凝胶注为色谱柱；流动相为水，流速0.5 mL/min；ELSD检测器参数：以压缩空气为载气，流速3.2 L/min，漂移管温度115℃，并选用Alltech 2000ES色谱工作站（浙江大学）；样品进样量为10 μL。根据葡聚糖凝胶柱的色谱图的峰形、出峰数量和主峰所占比例判断WBS020EPS1-2的纯度。此外，选用T-系列葡聚糖（T-5，T-10，T-40，T-70，T-500 和 T-2000） 作为标准多糖按照上述条件进行HPGPC-ELSD分析。以标准多糖相对分子质量对数和保留时间对数绘制标准曲线，根据样品出峰的保留时间（RT）推算多糖WBS020EPS1-2的平均相对分子质量。

1.8 UV扫描

取质量浓度为1.0 mg/mL的WBS020EPS1-2多糖溶液在UV-2450紫外分光光度计上扫描200～400 nm紫外区间的吸光谱。

1.9 单糖组分分析

WBS020EPS1-2多糖的单糖组分采用强酸水解后利用PMP柱前衍生法结合HPLC-DAD色谱法进行分析[16-17]。单糖标准品为甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖（内标），按照相同衍生化过程配置标准单糖供试液。将多糖水解样品和标准多糖样品分别于安捷伦1100高效液相色谱系统分析。色谱条件为：色谱柱为 Phenomenex Luna 5u C18（2） 100 Å 柱，流动相为体积分数17%的乙腈和体积分数83%磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0，体积比）等度洗脱，流速为 1 mL/min，检测波长245 nm，柱温为30℃，进样体积15 μL。

1.10 FT-IR光谱分析

称取 WBS020EPS1-2多糖干样 2～3 mg，用KBr法压片，在4000～450 cm-1的红外区间于PerkinElmer Spectrum 100系列傅立叶变换红外分光光度计进行扫描。

1.11 抗氧化活性分析

1.11.1 DPPH自由基清除活性 DPPH自由基清除活性的测定参考Jin Boo Jeong[18]所述方法执行，略做修改。简而言之，将多糖样品WBS020EPS1-2溶解到水中，配置成0.1～8.0 mg/mL一系列质量浓度梯度溶液。根据酶标板体积，取70 μL多糖样品溶液于96孔酶标板，加入180 μL体积分数0.004%DPPH乙醇溶液，混合均匀后在27℃条件下反应5 min（反应完全），然后在517 nm波长下用酶标仪测定吸光度。用水替代样品作阴性对照，用乙醇替代DPPH溶液作空白对照。Vc作标准抗氧化剂，试验重复3次。DPPH自由基清除活性按照如下公式（1）计算：

DPPH 自由基清除活性/%=[1-（Ai-A0）/Ac]×100（1）其中Ai为样品测量值，A0为空白对照，Ac为阴性对照。

1.11.2 ABTS自由基清除活性 ABTS自由基清除活性的测定参考Yang Tao所述方法[19]，并略作修改。简而言之，根据预实验结果，取30 μL多糖样品溶液于96孔酶标板，加入180 μL ABTS试液，混合均匀后在37℃条件下反应5 min，然后在734 nm波长下用酶标仪测定其吸光度。用水替代样品作阴性对照，用乙醇替代ABTS溶液作空白对照。Vc作标准抗氧化剂，试验重复3次。ABTS自由基清除活性按照如下公式（2）计算：

其中Ai为样品测量值，A0为空白对照，Ac为阴性对照。

1.11.3 亚铁离子螯合活性 亚铁离子螯合实验参考文献[20-21]中所述邻二氮杂菲紫外光谱检测方法，并略作修改。具体如下，先取0.3 mL多糖样品溶液或者水 （阴性对照）加入到装有0.3 mL浓度为150 mmol/L FeSO4·7H2O溶液的试管中，摇匀后在室温静置10 min，然后加入0.3 mL醋酸钠缓冲液（HAc-NaA，pH 4.6）和 0.3 mL质量分数为 0.1%1，10-邻二氮杂菲溶液来测量体系中未被螯合的Fe2+离子含量。用水替代FeSO4·7H2O溶液作空白对照。取200 μL上述反应完成溶液于96孔酶标板中，在510 nm条件下用酶标仪测定其吸光度。EDTA溶液作阳性对照。亚铁离子螯合率计算采用如下公式（3）：

其中Ai为样品测量值，A0为空白对照，Ac为阴性对照。

2 结果与讨论

2.1 内生真菌WBS020多糖的提取纯化及分离

经发酵、浓缩、石油醚和乙酸乙酯等初步脱脂和除色素后，再经过醇沉得到的内生真菌WBS020胞外多糖粗提物，呈现深棕褐色浸膏状，在4℃冰箱保存后呈块状。利用S-8型和D101型大孔吸附树脂对其进行多次脱色素处理，不仅获得了明显的除色素效果，还除去了一部分蛋白质等成分，并且整个吸附过程相对温和，不会破坏多糖成分结构[12-13]。利用酶法和Sevag试剂联用脱去多糖中剩余的蛋白质较相对单一方法脱蛋白质效率更高[14]，利用半透膜透析法可有效除去一些小分子物质。通过上述脱色素、脱蛋白质和除去小分子，成分的样品中多糖质量分数进一步提高。将经过纯化的多糖纤维素DEAE-52阴离子交换色谱柱后得到5个洗脱的多糖馏分，分别编号为WBS020EPS-1、WBS020EPS-2、WBS020EPS-3、WBS020EPS-4 和 WBS020EPS-5。 其中以 WBS020EPS-1 为主要成分（图 1（a）），且该成分为中性多糖（纯水洗脱得到的馏分）[22]，将其收集之后，浓缩冻干，经sephadex G-150进一步分离得到 2个馏分 （图 1 （b））， 分别编号为WBS020EPS1-1和WBS020EPS1-2，以后者质量较高。收集WBS0020EPS1-2并浓缩冻干后得到浅白色多糖粉末WBS0020EPS1-2。HPGPC-ELSD分析结果表明多糖WBS020EPS1-2为质量分数在95%以上的纯多糖。

2.2 多糖相对分子质量和UV分析

由于不同相对分子质量大小的葡聚糖在HPGPC-ELSD上的色谱峰保留时间（RT）的自然对数与其相对分子质量（Mw）的自然对数存在线性关系，通过测定已知相对分子质量标准葡聚糖在HPGPC-ELSD色谱上的RT值，得到了其Mw与RT值的线性关系式为：ln （Mw）=-8.039 9ln （RT）+33.983，R2=0.99-36。因此根据WBS020EPS1-2主峰的保留时间可以得到其平均分子质量约为3.137×104。

图1 菌株WBS020发酵液胞外粗多糖分离纯化柱色谱图Fig.1 Purification column chromatogram of the crude exopolysaccharide （EPS） extracted from the fermentation broth of strain WBS020

2.3 UV分析

如图2所示，从在200～400 nm扫描范围内的WBS020EPS1-2的UV扫描图中可以看出，在280 nm有一个较小的吸收峰，除此外整个曲线无其他吸收峰，说明色素和核酸成分已被除完，仅含有少量的蛋白质。取少量多糖进行试验，在其水溶液加入乙醇（乙醇的终体积分数控制在80%以上），多糖溶液溶解良好，表明其所含的蛋白质应该是结合在多糖链上的结合蛋白。另外，UV分析也显示上述大孔吸附树脂法和酶法与Sevag试剂联用已基本除去样品中的色素和蛋白质等杂质。

2.4 单糖组成分析

图2 WBS020EPS1-2多糖馏分UV扫描图（200～400 nm）Fig.2 UV spectra （200-400 nm） of polysaccharides WBS020EPS1-2

多糖的单糖组分分析采用PMP衍生HPLCDAD色谱法。由图3可知，在所选色谱条件下，衍生后的单糖可达到基线分离，且峰形良好。由图3所知，WBS020EPS1-2主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其摩尔比为0.43∶0.13∶10.00∶1.92∶0.11。 此外，由图 3 所示，在出峰时间为14.398 min处，有一个面积较大峰，但是由于未有标准品与之对应，所以暂时无法判断其成分种类，这也表明内生真菌多糖的单糖组分较为丰富，将更有利于产生出结构复杂的多糖产物。在WBS020EPS1-2中，葡萄糖为其主要单糖组分。由培养基中添加的单糖成分为葡萄糖推测菌株WBS020能够直接利用培养基中的葡萄糖来合成以葡萄糖为主的糖链。同时，半乳糖相对含量也相对较高，这也表明WBS020EPS1-2在主链或侧链中含有部分半乳糖的杂多糖。

图3 单糖PMP衍生化HPLC-DAD色谱图Fig.3 HPLC-DAD chromatography of monosaccharide standards after PMP derivatization

2.5 红外光谱分析

多糖WBS020EPS1-2的FT-IR光谱图如图4所示。在3400 cm-1处的强吸收为羟基的伸缩振动吸收峰。在2940 cm-1处为C-H的伸缩振动吸收峰，1420 cm-1出现的峰为C-H的变角振动，它和C-H键的伸缩振动构成了糖类的特征吸收峰。在1750~1700 cm-1区间内无吸收峰，表明WBS020EPS1-2多糖样品中不含有糖醛酸成分[23]，进一步证实其为中性多糖。1635 cm-1处可能为C=O的不对称伸缩振动导致的吸收峰，而之前试验的研究结果已经表明WBS020EPS1-2多糖为中性多糖，且UV分析中280 nm处的微弱吸收峰，表明可能存在酰胺羧基，此处信号峰可能是样品中存在着少量的与多糖结合的蛋白质引起，但需进一步验证。1300～1250 cm-1和1240 cm-1处无明显吸收峰，表明样品中无磷酸基和磺酸基取代。1149、1075 cm-1和1045 cm-1处的吸收峰归为糖苷键CO-C或C-O-H中的C-O的伸缩振动[24]，此3个吸收峰表明吡喃糖苷的存在。939 cm-1左右的吸收峰为α-构型葡聚糖的特征吸收峰[25]；871 cm-1处的吸收峰表示存在甘露糖，结合939 cm-1左右的吸收峰，可以判断存在甘葡聚糖[26]。可见多糖WBS020EPS1-2主要为α-构型葡萄吡喃糖和甘露吡喃糖组成的中性多糖，并且可能含有少量的结合蛋白。这与多糖的单糖组分分析和紫外扫描分析结果基本一致。但是作为摩尔分数次高的半乳糖在糖链中的构型，以及单糖的链接方式等还需要借助其它方法进一步分析。

图4 多糖组分WBS020EPS1-2的傅里叶变化红外光谱图Fig.4 FT-IR spectra of polysaccharide WBS020EPS1-2

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH自由基清除活性 DPPH是一种稳定自由基组成的深蓝色结晶粉末，通常用于天然产物对自由基清除活性的评价。如图5所示，分离自瓦布贝母内生真菌的多糖WBS020EPS1-2表现出较弱的DPPH自由基清除活性，其IC50值远低于所测样品的最大质量浓度8.00 mg/mL，而且其量效关系也不明显。可见多糖成分WBS020EPS1-2不适合清除DPPH自由基。

图5 瓦布贝母内生真菌WBS020EPS1-2多糖DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH free radical scavenging activities of the polysaccharideWBS020EPS1-2ofendophytic fungus from Fritillaria unibracteata var.wabuensis

2.6.2 ABTS自由基清除活性 ABTS自由基清除试验通常用于评价化合物总抗氧化活性[27]。如图6所示，来源于瓦布贝母内生真菌的多糖WBS020EPS1-2表现出良好的抗氧化活性，其IC50为1.93 mg/mL，在所测最大质量浓度8.00 mg/mL时清除率达到 （89.83±3.59）%。在所测样品质量浓度范围内随着质量浓度增加，其ABTS自由基清除活性也随之增强，其拟合线性公式为Y=6.9484X+36.609，R2=0.9629，可见ABTS自由基清除活性与样品质量浓度之间有良好的量效关系。虽然与阳性对照VC溶液相比，所得多糖活性仍然相对较低，但是多糖是大分子物质，在相同质量条件下多糖的活性中心远少于VC小分子，因此以其摩尔浓度相比而言，多糖表现出较强的ABTS自由基清除活性。

图6 瓦布贝母内生真菌WBS020EPS1-2多糖ABTS自由基清除活性Fig.6 ABTS free radical scavenging activities of the polysaccharideWBS020EPS1-2ofendophytic fungus from Fritillaria unibracteata var.wabuensis

2.6.3 亚铁离子螯合分析 亚铁离子（Fe2+）具有很强的助氧化活性，在溶液中会发生Fenton反应（Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH·），并通过破坏氢键和脂质过氧化酶加速细胞损伤[28]，可通过亚铁离子螯合作用，降低亚铁离子浓度，从而避免或者减小其氧化活性。1，10-邻二氮杂菲会结合亚铁离子形成稳定的有颜色的复合物，并且在510 nm处有最强的吸收峰[29]。如果样品具有螯合亚铁离子的活性，当样品加入后，亚铁离子浓度将降低，通过测定与1，10-邻二氮杂菲反应后颜色变化，就可测定溶液中螯合除去的亚铁离子的浓度。由图7所示，多糖WBS020EPS1-2表现出较强的亚铁离子螯合活性，在所测最大质量浓度8.00 mg/mL时螯合率达到（74.34±1.23）%，其 IC50为 4.52 mg/mL。并且在所测样品质量浓度范围内随着质量浓度增加，亚铁离子螯合能力也增强。其拟合线性公式为Y=7.706X+15.135，R2=0.9774，可见其样品质量浓度和亚铁离子螯合率之间有良好的量效关系。

图7 瓦布贝母内生真菌WBS020EPS1-2多糖亚铁离子螯合能力Fig. 7 Ferrous ions chelating activities of the polysaccharideWBS020EPS1-2ofendophytic fungus Fritillaria unibracteata var.wabuensis

3 结语

本试验中对一株分离自珍稀药用植物瓦布贝母的内生真菌F.tricinctumWBS020胞外多糖进行了研究，通过醇沉，除杂和分离最终得到了多糖成分WBS020EPS1-2。研究表明，WBS020EPS1-2平均相对分子质量约为3.137×104，为含有少量结合蛋白的中性多糖，其主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其中以葡萄糖摩尔分数最高，其次是半乳糖。而抗氧化活性研究表明，多糖WBS020EPS1-2对ABTS阳离子自由基具有良好的清除能力，对亚铁离子也有较强的螯合能力。本研究是首次对瓦布贝母内生真菌WBS020的多糖的研究，这对其他药用植物内生真菌的开发利用具有一定的参考价值，同时也对WBS020多糖成分的开发利用鉴定了基础。