荞麦蜂花粉多糖A的分离及其降血糖活性

钱明辉， 达热卓玛， 徐德平

（江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

蜂花粉作为一种高价值的天然食品，不仅营养丰富，还存在大量生物活性物质[1]，被称为“微型营养库”。而蜂花粉多糖作为花粉中的一种活性物质，具有增强机体免疫力[2-4]、抗病毒[5-6]、调节血脂[7]及抗肿瘤[8]、抗氧化[9]等多种活性。目前有关荞麦蜂花粉多糖的研究集中在提取工艺[10-11]与生物活性[12]上，而对荞麦蜂花粉多糖结构方面的研究尚少见报道。本文利用多种色谱技术对荞麦蜂花粉多糖进行分离，并对其化学结构、降血糖活性进行了研究，以期为荞麦花粉资源的进一步开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荞麦蜂花粉，购于内蒙库伦旗蜂场；昆明小鼠（60只，雄性，4周龄），购于上海斯莱克实验动物有限公司；链脲佐菌素（STZ），购于Sigma公司；盐酸二甲双胍，购于上海华氏制药有限公司；DEAE-52（40~50 μm）离子交换柱，购于上海生化试剂公司；HW-55F（30~60 μm）凝胶柱，购于日本 TOSOH 公司；Sephacryl S-400 （25~75 μm）、Sephadex G-100（10~40 μm）凝胶柱，购于瑞典 Pharmaeia 公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器和设备

不锈钢五谷杂粮磨粉机：浙江省温岭市创力药材器械厂产品；RAT-100D双层玻璃反应釜：无锡申科仪器有限公司产品；RE-5220型旋转蒸发仪：上海一科仪器有限公司产品；高速冷冻离心机：美国Thermo公司产品；罗氏卓越血糖仪：德国Roche Diagnostics GmbH公司产品；核磁共振仪 Avance 500 MHz：Bruker公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 荞麦蜂花粉粗多糖的制备 将10 kg荞麦蜂花粉粉碎后，过40目筛，投入100 L萃取罐，按料液质量体积比 1 g∶8 mL加入体积分数95%乙醇，并在60℃条件下提取3 h，过滤取滤渣，抽滤后的滤渣按1 g∶6 mL的料液比加入去离子水，并在60℃下提取3 h，过滤得上清液，真空浓缩至 1 L，按 1∶4的体积比加入体积分数95%乙醇并搅拌，静置一夜后，抽滤得沉淀物，沉淀物用无水乙醇洗涤3次，然后真空干燥、Sevag法脱蛋白、大孔树脂AB-8脱色，冷冻干燥得粗多糖。

1.3.2 DEAE-52离子交换柱分离 取粗多糖溶于蒸馏水，配成200 mg/mL的溶液，上样量为50 mL，进行 DEAE-52离子交换柱（6 cm×60 cm）分离，分别用蒸馏水以及0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱速度为6 mL/min，利用自动收集器收集洗脱液，10 mL/管，用苯酚-硫酸法检测，合并收集各含糖的峰。

1.3.3 凝胶柱分离 取离子柱下来的样品，依次上HW-55F （3 cm×100 cm）、Sephacryl S-400 （3 cm×100 cm）凝胶色谱柱进行分离，上样量为20 mL，质量浓度为40 mg/mL，洗脱液为蒸馏水，洗脱速度为2 mL/min，用自动分部收集器10 mL/管收集，经苯酚-硫酸法检测，合并收集各含糖的峰。

1.3.4 纯度鉴定 蒸馏水配成样品质量浓度5 mg/mL的多糖A溶液，在200～400 nm下进行紫外全扫描。多糖A上Sephadex G-100色谱柱鉴定其纯度，流速为2 mL/min，蒸馏水洗脱，苯酚-硫酸法检测。

1.3.5 多糖A的降血糖活性测定 小鼠禁食不禁水16 h，腹腔注射柠檬酸缓冲液配置的STZ溶液，剂量为120 mg/kg，注射体积与小鼠体质量比为10 mL/kg。7 d后将小鼠禁食12 h，剪尾采血，用罗氏血糖仪测小鼠空腹血糖，血糖值在11.1～24.0 mmol/L范围内的小鼠为造模成功小鼠。将造模成功小鼠分为高血糖模型组、阳性对照组、多糖A低剂量组、多糖A高剂量组4个实验组，同时设置正常对照组，每组各10只。正常对照组与高血糖模型组灌胃等体积的生理盐水，而多糖A低、高剂量组分别按 100、300 mg/（kg·d）的剂量灌胃多糖 A，阳性对照组按300 mg/（kg·d）的剂量灌胃盐酸二甲双胍，每天给药1次连续给药30 d，末次给药后禁食12 h，剪尾采血测定血糖。然后各组小鼠用葡萄糖溶液经口灌胃，剂量为2.0 g/kg，分别于给糖后0、15、30、60、120 min 测血糖值。

1.3.6 结构分析 多糖A以四甲基硅烷 （TMS）为内标物，以氘代吡啶为溶剂，利用核磁共振仪Avance 500 MHz对其进行135DEPT-NMR、13C-NMR和1H-NMR分析。

2 结果与讨论

2.1 离子柱分离结果

粗多糖用DEAE-52离子交换柱分离，经蒸馏水和不同浓度梯度的NaCl溶液洗脱后，得到图1所示的荞麦蜂花粉粗多糖洗脱曲线。从图1可以看出主要有4个洗脱峰，分别为 QQC1、QQC2、QQC3、QQC4，由洗脱液的吸光值可知，多糖组分主要集中在蒸馏水洗脱的QQC1与QQC2，而NaCl洗脱的QQC3与QQC4含量较少，因此将组分QQC2作为进一步研究对象。

图1 DEAE-52离子交换柱洗脱曲线Fig.1 Elution curve of DEAE-52 ion-exchange column

2.2 凝胶柱分离结果

多糖QQC2经HW-55F凝胶柱分离得到QQC2a、QQC2b、QQC2c 等 3 个组分，所得洗脱曲线如图2所示，其中QQC2a组分占中性多糖的质量密度最大，因此选其作为进一步分离对象。QQC2a经Sephacryl S-400凝胶柱反复分离，最终得到多糖A，由图3洗脱曲线可以看出，多糖A洗脱峰呈单一对称峰。

图2 HW-55F凝胶柱洗脱曲线Fig.2 Elution curve of HW-55F gel column

图3 Sephacryl S-400凝胶柱洗脱曲线Fig.3 Elution curve of Sephacryl S-400 gel column

2.3 纯度鉴定结果

从图4可知，多糖A溶液在260 nm与280 nm波长处不存在吸收峰，这说明多糖A不含核酸与蛋白质或者是含量极低。从图5可以看出，多糖A经Sephadex G-100色谱柱洗脱，洗脱峰呈单一对称峰，说明多糖A为均一多糖。

图4 多糖A紫外扫描图Fig.4 UV scan of polysaccharide A

图5 Sephadex G-100色谱柱洗脱曲线Fig.5 Elution curve of Sephadex G-100 column

2.4 多糖A的降血糖活性测定结果

从表1可以看出，与正常对照组相比，给药前的高血糖模型组、阳性对照组以及多糖A高、低剂量组的血糖值明显升高，差异显著（P＜0.01），说明造模成功。给药30 d后，高血糖模型组、阳性对照组以及多糖A高、低剂量组小鼠的血糖值分别是21.23、15.43、17.35、18.05，与高血糖模型组血糖值相比，阳性对照组以及多糖A高、低剂量组小鼠的血糖值都显著降低（P＜0.01），降低率分别为 27.44%、18.46%、15.11%，说明多糖A具有降低糖尿病小鼠血糖值的作用，但是与盐酸二甲双胍的降糖作用相比要弱。与多糖A低剂量组相比，多糖A高剂量组血糖值有下降趋势，但是高、低剂量组的血糖值无显著性差异，并没有体现显著的量效关系。

表1 多糖A对糖尿病小鼠血糖的影响（n=10，x±s）Table 1 Effect of polysaccharide A on blood glucose in diabetic mice（n=10，x±s）

从图6可知，正常对照组小鼠血糖在15 min达到最大值，随后逐渐下降，120 min时恢复到正常水平。模型组在30 min达到最大值，随后逐渐降低，120 min时还维持在较高水平。与正常组相比，模型组小鼠的血糖值下降缓慢，一直维持在高值，说明模型组小鼠对血糖敏感性弱，调节血糖能力差。多糖A低剂量组与高剂量组的血糖在15 min时达到最大值并且在30 min时有下降趋势，随后逐渐降低，120 min时恢复到了初始值附近，与模型组相比，多糖A低剂量组与高剂量组的血糖值下降得更快，同时能快速降低到初始值，表明多糖A低剂量组与高剂量组都有提高糖尿病小鼠糖耐量的能力。

多糖A低剂量组能显著降低糖尿病小鼠的血糖值同时提高其糖耐量，这表明了低剂量的多糖A就能起到很好的降血糖效果。多糖A低剂量组与多糖A高剂量组的血糖值相比，无显著性差异，说明多糖A的降糖效果与剂量没有显著量效关系，单一增加剂量不能显著提升多糖A对糖尿病小鼠的治疗效果。这可能与多糖A的降血糖机制有关，具体原因有待进一步研究。多糖A发挥降糖作用的原因可能是多糖A具有抗氧化作用，提高了还原型谷胱甘肽及超氧化物歧化酶的活性，从而修复受损伤的胰岛细胞或者使胰岛细胞再生，也可能是通过提高糖尿病小鼠胰岛的敏感性、促进葡萄糖转变为肝糖原或者是提高肝葡萄糖激酶活性的作用[13-15]来实现降血糖。荞麦蜂花粉多糖的降糖作用虽然比盐酸二甲双胍弱，但是毒性较小或无毒副作用，可以把荞麦多糖A开发成糖尿病患者的保健食品或者辅助治疗药品。

2.5 多糖A结构鉴定结果

多糖A的1H-NMR、13C-NMR、135DEPT-NMR谱见图7-8。从1H-NMR可见，在异头质子区（δ4.5~δ5.9）存在5个信号较强的H信号，分别是δ5.303、δ5.256、δ5.233、δ5.205、δ5.014， 这 5 个 H 应为糖上端基H。从13C-NMR可见，在δ90~δ115范围内存在5 个 C 信 号 ，分 别 是 δ110.19、δ109.62、δ109.12、δ106.10、δ105.34，这 5 个 C 应为糖上端基 C，可以推测多糖A含有5个化学环境不同的糖残基。根据丰度可以推测 δ106.1、76.5、75.3、73.5、71.4、72.2 应为主链，从化学位移值来看应为葡萄糖。从135DEPTNMR谱看出δ72.2为CH2，应为C6的信号，正常情况C6值为60左右，表明主链C6成苷键，因此推测主链为1→6连接。在碳谱中一般α构型异头碳化学位移值小于103，β构型的异头碳化学位移值大于103，多糖A主链C1的化学位移值为106.1，因此推测主链是β构型。

在碳谱中有δ176.36、173.36二个羧基信号，多糖A是蒸馏水洗脱下来的中性糖，所以排除存在糖醛酸的可能，紫外光谱显示在260 nm与280 nm波长处不存在吸收峰，这说明多糖A是不含蛋白质的，因此推测δ176.36、δ173.36应为2个氨基酸信号，并形成酰基键，氨基酸种类及连接位置有待进一步确定。

图7 多糖A1H-NMR图谱Fig.7 1H-NMR spectrum of polysaccharide A

图8 多糖A13C-NMR和135DEPT-NMR图谱Fig.8 13C-NMR and135DEPT-NMR spectrum of polysaccharide A

3 结语

荞麦蜂花粉粗多糖经DEAE-52离子交换柱、HW-55F、Sephacryl S-400凝胶柱依次分离，得到多糖A。多糖A具有降低糖尿病小鼠血糖值、提高糖尿病小鼠糖耐量的作用。通过多糖A的13C-NMR、135DEPT-NMR谱等分析可以推测多糖A大致的框架是主链由（1→6）-β-葡萄糖组成的，在侧链上连有氨基酸，荞麦蜂花粉粗多糖连有氨基酸在文献中属于首次报道，有关多糖A的精细结构还有待进一步研究。