聚乙烯醇双酶降解工艺条件优化

赵一凡 ， 刘 松 ， 李江华 *， 堵国成 ， 陈 坚

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，简称 PVA）是一种主要以1，3-二醇键的化学结构存在的、人工合成的高分子化合物，一般无味且呈粉末状。由于PVA具有许多优良特性，如乳化性、成膜性、高粘度、热稳定性等，被广泛应用于纺织、造纸等行业[1-5]。PVA作为纺织工业中织物上浆的浆料，能够使织物不易发生腐蚀和化学变化，同时可以增强织物的韧性。但为了加强棉织物对水的吸收[6]，经过上浆工艺的织物在成品前必须经过退浆处理以去除PVA。此外，退浆废水中的PVA亦对环境造成严重的污染[7]。因此，开发PVA高效降解技术成为研究热点。

目前PVA的降解方法主要包括：物理法、化学法和生物法[8]。物理法有泡沫分离、超滤、光催化、微波辐射等技术。尽管这些技术会产生一定的处理效果，但它们操作起来较复杂，投资费用和运行费用都较高，因此工业化应用难度较大[8]。化学法是采用酸、碱或氧化剂在高温条件下破坏PVA的长链结构使其降解，但易对棉纤维造成较大损伤，且能耗高。PVA是为数不多的生物可降解的水溶性材料[9]，采用生物方法降解PVA具有运行费用低、二次污染少等优点，具有良好的发展前景。

PVA生物降解包括微生物法和酶法[3]。目前，研究者们得到的可以降解PVA的微生物包括单菌[10-12]、共生菌[13-15]和混合菌[16-17]。一般情况下，对于0.1%~0.5%质量分数的PVA，大多数细菌将其降解90%以上需要3~12 d[9]，降解速率较低。就PVA的降解过程而言，其本质上是酶的作用。主要有以下3种已报道的 PVA 降解酶：PVA 氧化酶（SAO，EC1.1.3.30）、PVA 脱氢酶 （PVADH，EC1.1.99.23）和氧化型PVA水解酶 （OPH，EC3.7.1.7）。生物降解PVA过程如下（图1）。第一步：PVA在SAO（以 O2作为电子受体）或PVADH（以 PQQ作为电子受体）的作用下，脱氢氧化生成对应的酮基化合物；第二步：酮基化合物被 OPH水解[18]。其中，对SAO的研究还没有深入到基因水平[19]，只停留在野生酶的纯化和性质研究等方面。

在前期工作中，研究室实现了Sphingopyxissp.113P3 PVADH基因[20]和OPH基因[21]的异源高效表达。在此基础上，研究对PVADH和OPH双酶降解PVA的工艺条件进行了优化，实现PVA酶法高效降解。

图1 推测的PVA降解途径Fig.1 Conjectural PVA degradation pathways

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 PVA脱氢酶 （PVADH）产生菌P.pastorisGS115/pPIC9K/tPVADH[20]及氧化型PVA水解酶（OPH）产生菌E.coliBL21（DE3）/pET20b（+）/soph[21]为本实验室构建所得。

1.1.2 培养基 YPD液体培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母提取物 10 g/L；

YPD固体培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母提取物 10 g/L，琼脂 20 g/L；

BMGY液体培养基：甘油10 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母粉 10 g/L，YNB 13.4 g/L，100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 pH 6.0，生物素 4×10-3g/L；

BMMY液体培养基：蛋白胨 20 g/L，酵母粉 10 g/L，YNB 13.4 g/L，100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 pH 6.0，生物素 4×10-3g/L，甲醇体积分数1%；

LB培养基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L；

固体LB培养基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 20 g/L；

TB培养基：酵母粉 24 g/L，蛋白胨 12 g/L，磷酸二氢钾2.3 g/L，磷酸氢二钾12.5 g/L，甘油 5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 将P.pastorisGS115/pPIC9K/tPVADH活化培养后，以体积分数3%的接种量接入BMGY培养基中，于30℃、200 r/min转速下进行培养。在培养24 h后收集菌体并重悬到BMMY培养基中，以体积分数1%甲醇为唯一碳源，于28℃、200 r/min转速下进行诱导表达。甲醇每24 h补加体积分数1%，在上述条件下诱导120 h。

将重组菌E.coliBL21（DE3）/pET20b（+）/soph接种在LB培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）中，于37℃、200 r/min转速下进行种子发酵。在培养12 h后菌液的OD600达到 4.5~5，以体积分数3%的接种量接种入 TB培养基 （含100 μg/mL氨苄青霉素），进行诱导，于25℃、200 r/min转速下恒温发酵108 h。

1.2.2 响应面实验设计 根据单因素实验和爬坡实验，选择 PVADH 酶量（100~150 U/mL）、pH（7~8）、温度（39~43℃）为自变量，PVA降解率为响应值，应用Design-Expert V 8.0.6软件设计三因素三水平Box-Behnken试验（表1）。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

自变量与响应变量之间的关系可由一个拟合的二阶多项式方程描述[23]：

式中，R为PVA降解率（%）；A为PVADH酶量的编码值；B为pH的编码值；C为酶反应温度的编码值；β0为常数项系数；β1、β2、β3为线性系数；β11、β22、β33为二次项系数；β12、β13、β23为交互系数。

1.2.3 PVA浓度检测方法 PVA浓度的测定（用改良的Finley法[22]）：在10 mL比色管中分别加入待测样品400 μL，25 g/L的硼酸3 mL和0.1 mol/L I2-KI 0.3 mL，用去离子水定容到10 mL，混匀后放于室温下避光静置10 min，在690 nm处测定其吸光值。PVA降解率计算如下式（1）：

式（1）中，β为PVA降解率，α0为反应前的 PVA质量浓度（g/L），α1为反应后的 PVA 质量浓度（g/L）。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

为优化PVA的降解条件，研究了PVADH酶量、OPH酶量、酶反应温度、pH、Ca2+浓度和底物质量浓度对PVA降解率的影响。单因素实验的初始条件为：PVADH 150 U/mL、OPH 10 U/mL、酶反应温度37℃、pH 7、Ca2+浓度1 mmol/L、 底物PVA质量浓度 1 g/L，PQQ 浓度 6 μmol/L，反应 1 h。

初始条件下，研究PVADH酶量和OPH酶量对PVA降解的影响。结果显示，PVADH酶量在0~200 U/mL的范围时，PVA的降解率随着PVADH酶量的增加而提高；进一步提高PVADH酶量，PVA降解率略有降低；故确定PVADH酶量为200 U/mL（图2（a））。在0~8 U/mL的范围内，PVA降解率随着OPH酶量的增加而增加；当OPH酶量在8~14 U/mL的范围时，降解率变化不显著（图2（b））。由于OPH催化的底物是PVADH的产物，OPH对降解率的影响依赖于PVADH的催化速率。基于此，选择OPH酶量为12 U/mL。

图2 PVADH酶量、OPH酶量、酶反应温度、pH、Ca2+浓度和底物质量浓度对PVA降解率的影响Fig.2 Effect of PVADH concentration，OPH concentration，enzymatic temperature，pH ，Ca2+concentration and substrate concentration on PVA degradation efficiency

如图2（c）所示，当温度升高至47℃时PVA降解率达到了最大值，更高的温度可能使PVA降解率下降。由图2（d）可知，PVA最适酶解pH 为9。Ca2+可以作为酶促反应的激活剂和稳定剂，0～1 mmol/L的Ca2+提高了PVA的酶促降解率，进一步提高Ca2+使 PVA 降解率明显下降（图 2（e）），故最适 Ca2+浓度为1 mmol/L。在以上初始酶反应条件下，PVADH和OPH能有效降解1 g/L PVA，提高PVA质量浓度导致降解率下降（图 2（f））。

2.2 爬坡实验

基于以上单因素实验，选择PVADH酶量、pH、酶反应温度3个影响显著的因素进行最陡爬坡实验，从表2来看，爬坡实验第3组PVA降解率最高，因此响应面的中心点应该在其附近产生。故以第3组条件为后续实验的中心点进行分析。

2.3 响应面优化

通过爬坡实验确定了Box-Behnken实验的中心点为PVADH酶量 125 U/mL、pH 7.5、酶反应温度41℃。根据中心点，Box-Behnken试验设计及结果见表3。利用Design-Expert V 8.0.6软件对表3的试验数据进行多元回归拟合，PVA降解率 （R）对PVADH 酶量（A）、pH（B）、酶反应温度（C）的二次多项回归方程为：

表2 爬坡实验安排表Table 2 Design and results of path of steepest ascent experiment

对模型进行方差分析。由表4可得出，试验设计模型P＜0.0001，即该模型具有高度的显著性；模型中，单个因素中的B、C对PVA降解率的影响显著，交互项AB对PVA降解率的影响较显著，二次项A2、B2及C2对PVA降解率的影响显著。由F值可知，单因素对PVA降解率的影响顺序为B（pH）＞C（温度）＞A（PVADH酶量）。模型的失拟概率仅为0.0711，说明拟合的回归方程符合实际情况。相关系数R2=0.9841，校正系数RAdj=0.9638，即不能由此模型进行解释的降解率总变异只有3.62%，这表明模型与实际情况拟和较好，可用此模型对PVA降解率进行分析和预测。

表3 Box-Behnken设计试验方案及响应值Table 3 Box-Behnken design and the correspondingresults

表4 回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance results for response surface quadratic model

为更直观地理解实验因素对PVA降解率的影响，利用Design-Expert V 8.0.6软件得到了二次方程的三维响应面图，如图3所示。呈马鞍形或椭圆形的等高线表示参数与参数之间交互作用显著，呈圆形的等高线则表示参数与参数之间交互作用不显著。由此，交互项AB影响较显著，AC、BC次之。

图3PVADH酶量与pH、PVADH酶量与温度及pH与温度交互作用的响应面图Fig.3 Response surface showing the effects of AB、AC and BC on PVA degradation efficiency

利用Design-Expert V 8.0.6软件预测出双酶酶法降解PVA的最佳降解工艺：PVADH 122.54 U/mL，pH 7.69，酶反应温度40.77℃。在此条件下，PVA的降解率为34.15%。根据实际情况，对该预测的工艺条件进行修正：PVADH 123 U/mL，pH 7.7，酶解温度41℃。在此条件下，独立进行3次实验，反应1 h，得到的PVA降解率的平均值为34.07%，与理论值相符，说明该工艺可靠。

2.4 PVA酶促降解机制分析

目前，大多数研究者大都采用自己筛选的菌种，不同的菌种涉及到的PVA降解酶组合也都不尽相同。一般认为PVA酶促降解经由PVADH脱氢得到酮基化合物 （氧化型PVA），OPH再将氧化型PVA水解为小分子。但也有学者认为氧化型PVA的结构并不稳定，它的降解也可以自发进行[7]。基于此，有必要对PVA酶促降解过程进一步验证。结果分析显示，PAVDH和OPH双酶共同降解PVA 4 h后，PVA接近完全降解；而PVADH单独降解PVA时，PVA质量浓度总体上在下降，但经过大约12 h，PVA才基本降解完全。上述结果表明，PVADH可以单独降解PVA，但降解速率较慢，而OPH可以加速氧化型PVA这种不稳定结构的进一步降解，从而提高降解速率。

图4 降解效果对比Fig.4 Comparison of degradation effects

3 结 语

生物法是一种“绿色环保”的处理技术，它将微生物或PVA降解酶应用于纺织退浆工艺或下游的废水处理中，具有对织物损伤小、排污少、废水处理简单、处理能耗低、对设备要求低等优势。本研究应用响应面法和多项式数学模型对PVADH和OPH双酶降解PVA的工艺条件进行优化。得到的优化条件为：PVADH 123 U/mL，OPH 12 U/mL，pH 7.7，酶解温度 41 ℃，Ca2+浓度 1 mmol/L，PQQ 浓度 6 μmol/L，反应1 h，对1 g/L PVA降解率的平均值为34.07%，与响应面的预测值（34.15%）基本一致。当酶解反应经过4 h，降解率达到了95%以上。大多数细菌将0.1%~0.5%质量分数的PVA降解90%以上，一般情况下需要3~12 d[9]，与微生物法相比该双酶降解工艺可实现PVA的快速降解。研究结果为进一步酶法生物降解PVA的放大和应用奠定了基础。

但该双酶降解工艺需要外加微量PQQ，PVADH只有结合辅助因子PQQ才具有催化活性，而PQQ的添加提高了使用成本。因此为尽快实现酶法降解PVA的应用，提高酶法降解PVA的竞争力，今后应积极开展对可替代PQQ的廉价辅因子的研究以及对PQQ体外再生系统的探索。