工业大麻雌株花叶多糖抑菌活性及稳定性分析

郭孟璧， 郭 蓉， 郭鸿彦， 张庆滢， 陈 璇， 许艳萍， 杨若菡， 杨明

（云南省农业科学院 经济作物研究所，云南 昆明 650205）

工业大麻是经过遗传改良的大麻品种，其毒性成分四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）＜0.3%，经许可可以合法种植加工利用[1]。它是一种食用、药用、纤维用为一体的高经济价值的作物，其茎秆纤维可用于纺织、建材和造纸，籽实可用于食品和药品[2]，在云南、内蒙古、黑龙江等多个省份均有广泛的种植分布[3]。在工业大麻纤维收获时，工业大麻雌株的花穗和叶片约占整个植株质量的24%～25%[4]，若弃之不用则造成花叶资源的巨大浪费。因此，工业大麻雌株花叶的利用成为工业大麻多用途开发亟待解决的主要问题之一。

现有研究表明，大麻纤维对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、白色念珠菌和对造成人体脚气病的须癣毛癣菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌3种真菌具有显著的抑制效果，其抗菌性可能与微量的脂溶性大麻酚类成分有关[5-7]。大麻茎皮脱胶产生的果胶中提取的皂苷类成分具有显著的抗真菌作用[8]。大麻花叶中含有多糖、大麻酚类、萜类及黄酮等多种活性物质，其中大麻酚类化合物对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有明显的抗菌性能，齐墩果烯、齐墩果酸对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和白色念珠菌的抑制作用明显[9-18]。植物多糖因其抑菌、抗肿瘤、增强免疫等方面的生理活性越来越受到广泛的重视，然而目前尚未见国内外对工业大麻花叶多糖抑菌活性进行研究的相关文献报道。

本文作者以云南省种植面积最大的工业大麻品种“云麻1号”（THC质量分数为0.15%）雌株花叶为材料，采用水提醇沉法得到工业大麻雌株花叶粗多糖（PFLFIH），研究其对9种常见人体致病菌的体外抑菌活性和稳定性，为开发成本低廉、天然无毒的新型工业大麻花叶抑菌剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物样品 工业大麻雌株花叶：采自云南省农业科学院经济作物研究所试验地，为纤维型种植模式下“云麻1号”雌株始果期的顶部花穗，室内阴干，粉碎后过40目筛，置于-4℃下保存。

1.1.2 供试菌种 肺炎链球菌 （ATCC31001-19），购自北京生物制品检定所；蜡样芽孢杆菌（FSCC115002）、新生隐球菌（GIM2.209），购自广东省微生物菌种保藏中心；其余菌种均由昆明医科大学病原生物学与免疫学试验室提供。所选菌种见表1。

表1 供试菌种Table 1 Testing microorganisms

1.1.3 培养基 蜡样芽孢杆菌采用厂家自带液体培养基，大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌采用营养肉汤培养基，白色念珠菌、新生隐球菌用沙保弱培养基，肺炎链球菌用血清肉汤培养基[19]。

1.1.4 仪器设备 VS-840K-U超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品；H6303i生物显微镜，重庆光电仪器有限公司产品；Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-50S11，上海博迅实业有限公司医疗设备厂制造；LRH-250A生化培养箱，广东韶关市泰宏医疗器械有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PFLFIH的制备 取1.1.1中粉碎过的干燥花叶粉末放入索氏提取器中，依次用石油醚（60～90℃）和体积分数70%乙醇回流，除去色素、酚类等杂质，避光自然干燥。取上述处理过的花叶500 g，加蒸馏水3.5 L，沸水浴提取2 h，期间适当补充蒸馏水。提取液过滤后，滤渣再重复提取2次。滤液合并后加热浓缩至生药与浸膏质量比为1∶5，加入体积分数95%乙醇，至溶液中乙醇的体积分数为80%，均匀搅拌，4℃静置24 h，过滤，依次用体积分数80%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，干燥后即得PFLFIH。

1.2.2 总糖和蛋白质质量分数的测定 PFLFIH的总糖质量分数测定以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法[20]。蛋白质质量分数的测定以牛血清白蛋白为标准品，采用考马斯亮蓝染色法[21]。

1.2.3 THC含量的测定 称取干燥样品0.2000 g，用正己烷∶乙酸乙酯（体积比9∶1）溶液10 mL超声提取5 min，静置30 min后，用0.425 μm滤膜过滤后待测。采用液相色谱法[22]测定样品的THC质量分数。1.2.4 抑菌活性的测定 将供试菌种配置成菌液浓度为1×107CFU/mL的菌悬液，接种于相应固体平板培养基上。将多糖配制成300 mg/mL的样品液，-4℃保存备用。采用K-B纸片法[23]，吸取20 μL样品液于直径为6 mm经灭菌的滤纸片上，以无菌水作空白对照，阴干后贴于各培养基表面，放37℃培养箱培养18～24 h后，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，设置3个重复。平均抑菌圈＞7 mm，则有抑菌活性。

1.2.5 最低抑菌浓度（MIC）的测定 将多糖用对倍稀 释 法 分 别 配 制 成 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781、0.39、0.195 mg/mL（编号 1—10），设置不加药液的为阳性对照，各试管的菌液接种量均为5×105CFU/mL，同时设置不加药液、不接种菌的为阴性对照，37℃培养24 h，设置3个重复。

1.2.6 最低杀菌浓度（MBC）的测定 将1.2.5中的含药菌液接种至相应的培养基平皿中，于37℃继续培养24 h，用活菌计数法记录试验平皿上的菌落，平均小于5个菌落的最小稀释度的药物浓度即记录为最低杀菌浓度（MBC），设置3个重复。

1.2.7 抑菌稳定性测定 将多糖分别进行紫外线照射、温度、氧化剂与还原剂、不同酸碱处理后，采用1.2.4操作，记录抑菌圈直径，设置3个重复。采用Spss软件中LSD方法进行差异显著性分析 （P＜0.05）。

紫外线处理：用波长为253.7 nm的紫外线照射样品，照射强度为30 W/cm2，照射距离为60 cm，照射时长设为 30、60、120 min；

温度处理：将样品于50、80、121℃下分别烘干处理2 h；

不同pH值溶液处理：用相同浓度（6 mol/L）的HCl和 NaOH 配制 pH 值为 4、5、6、7、8、9、10 的水溶液，将样品分别溶解于不同pH值溶液中，室温下放置24 h；

氧化剂与还原剂处理：分别用质量分数为0.50、1.00、5.00 的 H2O2或 Na2SO3溶液处理样品，室温下放置24 h。

2 结果与分析

2.1 PFLFIH的产率及化学组成

用水提醇沉法提取PFLFIH，得率为7.25%。采用苯酚-硫酸法测得该粗多糖的总糖质量分数为81.0%，采用考马斯亮蓝染色法测定得其蛋白质质量分数为7.41%。

2.2 工业大麻雌株花叶及PFLFIH中的THC质量分数

按1.2.3方法检测，“云麻1号”干燥雌株花叶中的THC质量分数为0.15%，而从PFLFIH中未检测到THC。利用THC不易溶于水的性质，采用热水提取乙醇沉降的工艺有效避免了THC在多糖中的富集，得到的多糖无毒品滥用隐患。

2.3 PFLFIH对不同供试菌种的抑菌活性

PFLFIH对金黄色葡萄球菌有明显抑菌效果，对其他供试的人体致病菌无抑制作用（见表2）。

表2 PFLFIH对不同供试菌种的抑菌活性Table 2 Antimicrobial abilities of PFLFIH

2.4PFLFIH对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC

PFLFIH对金黄色葡萄球菌的MIC为3.125 mg/mL（见表 3），MBC 值为 6.25 mg/mL（如图 1），杀菌效果显著。

表3 工业大麻花叶多糖对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果Table 3 MIC of PFLFIH against S.aureas

图1 工业大麻多糖对金黄色葡萄球菌的MBC测定结果Fig.1 MBC results on S.aureus of PFLFIH

2.5 不同处理对PFLFIH抑制金黄色葡萄球菌活性的影响

2.5.1 紫外线照射对PFLFIH抑菌活性的影响 不同时长的紫外线照射后，PFLFIH的抑菌圈直径在15.3~15.7 mm之间波动，与对照（16.3 mm）无显著性差异（图2），抑菌活性基本保持不变，对紫外线照射耐受性能较好。

图2 不同时长紫外线照射后PFLFIH抑制金黄色葡萄球菌活性的变化Fig.2 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by UV irritation for different time

2.5.2 温度对多糖抑菌活性的影响 经温度50~121℃的热处理后，抑菌圈直径在14.7~15.3之间波动，与对照相比无显著差异，抑菌活性表现稳定，具有较好的热稳定性。

图3 不同温度处理后PFLFIH抑制金黄色葡萄球菌活性的变化Fig.3 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by different temperatures

2.5.3 pH值对多糖抑菌活性的影响 PFLFIH在中性（pH为7）水溶液中的抑菌活性最强，在酸性与碱性水溶液中其抑菌活性均显著降低（图4）。pH值分别为 4、6、8、10时，与中性水溶液比较，多糖对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别缩小9.8%、9.8%、9.8%和14.1%。

图4 pH值对PFLFIH抑制金黄色葡萄球菌活性的影响Fig.4 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by pH values of solutions

2.5.4 氧化剂和还原剂对多糖抑菌活性的影响PFLFIH在质量分数为0.5%～5.0%的氧化剂或还原剂溶液处理下，抑菌圈直径分别在15.3~15.7和15.3~16.3之间波动（图5），和对照相比抑制金黄色葡萄球菌的活性基本保持不变，抗氧化还原能力较强。

图5 氧化剂和还原剂对PFLFIH抑制金黄色葡萄球菌活性的影响Fig.5 Effects of oxidant and reducer on the antimicrobial activities of PFLFIH

3 结 语

本研究中采用水提醇沉法得到的PFLFIH总糖质量分数为81.0%，蛋白质质量分数为7.41%，不含有THC。该多糖对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性，并且具有杀菌效果，最低抑制浓度 （MIC）为3.125 mg/mL，最低杀菌浓度（MBC）为 6.25 mg/mL。

PFLFIH具有较好的耐紫外线、耐高温和耐氧化剂与还原剂的能力，在中性溶液环境下抑菌活性最强。酸性或碱性溶液的处理可能导致多糖发生变化，从而降低了对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。该多糖的组成及抑菌机理目前尚不明确，尚需进一步研究和探讨。植物源抑菌剂因具有安全、来源广泛、专一性强等优点日益受到关注，成为开发应用的热点。工业大麻雌株花叶多糖能够有效抑制并杀灭金黄色葡萄球菌，稳定性较好，提取工艺流程简单、成本低廉且无毒品安全隐患，具有巨大的开发潜力。