基于NCX/SERCA2a平衡假说探讨燧心胶囊对心肌梗死后心衰大鼠的心肌保护作用*

郭丹丹 于思明 张鸿婷 赵海燕

（1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

心力衰竭属于各类心血管疾病发展的末期阶段，发病率、致残率较高，对患者的生命安全带来严重的威胁［1］。近期研究显示细胞内钙调控异常与心力衰竭的发生有关，钠钙交换蛋白（NCX）与肌浆网钙泵2a（SERCA2a）水平的异常是心律失常或心力衰竭发生的共同通路，因此调控心肌细胞钙离子转运平衡已成为心力衰竭治疗的研究方向［2-3］。燧心胶囊为中药制剂，具有温阳利水、益气活血的功效，经临床证实可显著改善心力衰竭患者临床症状，提高患者左室射血分数（LVEF），具有抗心衰的效果［4］，然而燧心胶囊作用机制目前尚不清楚。本研究通过结扎左冠状动脉前降支法复制心梗后心衰大鼠模型，初步探讨燧心胶囊对心力衰竭大鼠心肌NCX/SERCA2a平衡的影响，以期为燧心胶囊的临床应用提供一定的参考。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量180～220 g，6周龄，购于哈尔滨医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（黑）2018-0018。对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》，所有大鼠均置于统一条件下，12 h交替光照，温度为25℃，湿度50%～70%，饲养1周后用于模型制备。

1.2 试药与仪器

燧心胶囊为黑龙江中医药大学附属第二医院自制药，由制附子、红参、丹参、茯苓、白术、泽泻组成；卡托普利片（浙江南洋药业有限公司）；血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）检测试剂盒（Solarbio，美国）；氯化三苯硝基四氮唑红（TTC）染液（sigma，美国）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Abcam，英国）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、RIPA裂解液（碧云天生物技术研究所）；鼠抗NCX、SERCA2a、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Cleaved-Caspase-3、β-actin一抗（Sigma-Aldrich，美国）；HRP二抗（CST，美国）；VevoR1100小动物超声成像系统（VisualSonics，加拿大）；CKX41倒置显微镜（Olympus，日本）；EC3-410凝胶成像系统（UVP，美国）；CM3050S冷冻切片机（Buffalo Grove，美国）；BX51荧光显微镜（Olympus，日本）。

1.3 模型制备

参考文献［5］方法，通过腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，使大鼠处于仰卧位，胸部备皮后，进行常规消毒；将电极针放置在大鼠四肢皮下，对心电图进行监测；沿大鼠左侧第4/5肋间剪开皮肤，钝性分离肌肉，暴露心脏，在左心耳边缘下方2 mm处结扎左冠状动脉前降支；当结扎部位及附近心肌变白，心电图ST段抬高时，表明结扎成功［6］。另外选取12只大鼠作为假手术组，开胸后仅栓线不进行结扎。正常饲养4周后，采用超声检测大鼠LVEF，当LVEF≤50%［7］时，则提示心力衰竭模型大鼠制备成功，排除制备过程中死亡、未达到标准的大鼠，共60只大鼠造模成功。

1.4 分组与给药

大鼠造模成功后分为模型组及燧心胶囊低、中、高剂量组和阳性药物组，每组12只，另取12只正常大鼠为假手术组。于造模后次日灌胃相应药物，燧心胶囊低、中、高剂量组予燧心胶囊水溶液2.7、5.4、10.8 g/kg［8］；阳性药物组灌胃卡托普利片水溶液5.83 mg/kg［9］，假手术组、模型组灌胃10 mL/kg生理盐水。各组均连续给药4周。

1.5 超声检测大鼠心室功能

末次给药后，充分麻醉大鼠，采用小动物超声仪对大鼠左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、LVEF、左室舒张期后壁厚度（LVPWDd）、左室收缩期后壁厚度（LVPWDs）、左室缩短分数（LVFS）检测并记录，连续检测3次心脏周期求得平均值。

1.6 标本采集与检测

超声检测结束后，尾静脉取血1 mL，置于抗凝管内，3 000 r/min离心3 min，保存上清置-20℃。各组随机选取6只大鼠，麻醉后，于颈总动脉逆行注射1 mL 0.5%伊文思蓝，迅速处死取出心脏，置于-80℃过夜，用于TTC染色；剩余6只大鼠麻醉后处死，摘除心肌组织，迅速进行左心室重量指数分析，随后将一部分心肌组织置于4%多聚甲醛中固定，其余部分组织切碎后置于液氮中保存。

1.6.1 大鼠左心室质量指数分析 心脏组织经清洗后，滤纸吸干，称取左心室质量，左心室质量指数（LVMI）=左心室质量（mg）/大鼠体质量（g）。

1.6.2 血清AngⅡ、ALD水平检测 取出冻存血清，参照放射免疫检测试剂盒对血清中AngⅡ、ALD水平进行检测。

1.6.3 TTC染色评估大鼠心肌梗死 取出冻存心脏，将左心室切成5个2 mm的横切面，在含有1%TTC的磷酸盐缓冲液中孵育20 min，正常心肌染色为紫红色，梗死区域呈淡白色，拍照ImageJ version 1.6软件定量分析测量梗死体积、总体积，计算梗死体积比例=梗死体积/总体积×100%。

1.6.4 HE染色观察心肌组织形态 心肌组织在4%多聚甲醛中固定48 h后，经乙醇水合、石蜡包埋后，制备4 μm心肌组织石蜡切片，采用HE染色试剂盒对切片染色，树脂封片后，置于用光学显微镜观察心肌结构损伤情况。

1.6.5 TUNEL试剂盒检测心肌细胞凋亡 将心肌组织切片经脱蜡、脱水、再水化后置于含20 μg/mL蛋白酶K缓冲液中，室温下孵育15 min，PBS冲洗后，添加TUNEL反应液在室温下孵育1 h，置于荧光显微镜镜下观察细胞凋亡情况，拍照保存，用Image-J软件分析对心肌细胞凋亡率，细胞凋亡率（%）=阳性染色细胞数目/总细胞量×100%。

1.6.6 蛋白免疫印迹分析 取出冻存组织研磨后，加入RIPA溶解缓冲液冰上放置30 min，离心后收集上清，BCA法检测上清液蛋白质浓度。采用10%SDSPAGE电泳分离蛋白，转移至PVDF膜上，用含有5%的脱脂牛奶膜封闭，在4℃温度下，加入一抗稀释液（1∶500），过夜孵育；37℃下加入二抗稀释液（1∶5 000）培养1 h，发光显影后，置于凝胶成像仪中观察保存蛋白条带图，并用Image-J软件定量分析蛋白条带表达量。

1.7 统计学处理

应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（）表示，两组间对比采用t检验，多组间对比采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组大鼠心肌组织形态学观察

见图1。HE染色显示，假手术组心肌组织结构正常，细胞形态完整，肌原纤维排规则。模型组心肌纤维断裂，排列紊乱，心肌细胞水肿、变形、呈坏死状，伴有炎性细胞浸润。燧心胶囊干预各组、阳性药物组心肌细胞坏死程度降低，炎性细胞浸润程度减弱。

2.2 各组大鼠心室功能指标比较

图1 HE染色观察心肌组织形态学变化（HE染色，200倍）

见表1。与假手术组相比，模型组LVEDD、LVESD均显著升高，LVPWDs、LVEF、LVFS均显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，燧心胶囊各剂量组与阳性药物组LVEDD、LVESD均显著降低，LVPWDs、LVEF、LVFS均显著升高（P＜0.05）。与阳性药物组相比，燧心低剂量组LVEDD及燧心低、中剂量组LVESD均显著升高，燧心低、中剂量组LVEF均显著降低（P＜0.05）。燧心胶囊各剂量组LVEDD、LVESD、LVEF比较差异具有统计学意义（F=14.086、11.573、19.741，P＜0.05），LVEDD、LVESD随剂量增加呈下降趋势，LVEF则呈上升趋势。

表1 各组大鼠心室功能参数比较（±s）

表1 各组大鼠心室功能参数比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与阳性药物组比较，△P＜0.05。下同

组别假手术组模型组燧心低剂量组燧心中剂量组燧心高剂量组阳性药物组n 6 6 6 6 6 6 LVEDD（mm）5.79±0.84 10.05±0.76*8.78±0.69*#△7.35±0.71*#6.86±0.54*#6.78±0.76*#LVESD（mm）2.95±0.42 8.79±0.96*7.57±0.83*#△6.27±0.76*#△5.64±0.49*#5.37±0.52*#LVPWDd（mm）1.73±0.49 1.65±0.38 1.68±0.39 1.66±0.41 1.63±0.42 1.67±0.43 LVPWDs（mm）3.19±0.51 1.81±0.35*2.24±0.30*#2.35±0.73*#2.54±0.51*#2.58±0.42*#LVEF（%）82.53±10.48 35.65±3.65*43.44±4.82*#△52.36±5.81*#△63.27±5.74*#64.66±6.13*#LVFS（%）43.44±3.39 28.82±2.26*35.75±3.68*#37.13±2.48*#39.06±3.26*#39.15±3.15*#

2.3 各组大鼠心肌梗死体积、左心室质量指数及心肌细胞凋亡的影响

见图2～图3，表2。与假手术组比较，模型组心肌梗死体积比例、LVMI、心肌细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，燧心胶囊各组与阳性药物组心肌梗死体积比例、LVMI、心肌细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05）。与阳性药物组相比，燧心低、中剂量组心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）。燧心胶囊各剂量组心肌梗死体积比例、心肌细胞凋亡率比较差异具有统计学意义（F=30.650、53.129，P＜0.05），且随剂量增加呈下降趋势。

2.4 各组大鼠血浆AngⅡ、ALD水平比较

见表3。与假手术组比较，模型组血清AngⅡ、ALD水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，燧心胶囊各组与阳性药物组血清AngⅡ、ALD水平显著降低（P＜0.05）。与阳性药物组比较，燧心低剂量组AngⅡ、ALD显著升高（P＜0.05）。燧心胶囊各剂量组AngⅡ比较差异具有统计学意义（F=4.634，P＜0.05），且随剂量增加呈下降趋势。

图2 TTC染色评估大鼠心肌梗死体积

图3 TUNEL法观察心肌细胞凋亡（100倍）

表2 各组大鼠心肌梗死体积比例、LVMI比较（±s）

表2 各组大鼠心肌梗死体积比例、LVMI比较（±s）

组别假手术组模型组燧心低剂量组燧心中剂量组燧心高剂量组阳性药物组n 6 6 6 6 6 6梗死体积比例（%）9.65±1.91 40.82±4.68*29.35±1.41*#△20.86±3.47*#△16.31±3.42*#15.05±2.73*#LVMI（mg/g）1.90±0.28 2.82±0.33*2.41±0.29*#2.33±0.26*#2.29±0.27*#2.26±0.25*#凋亡率（%）7.68±1.32 41.27±3.78*28.97±3.51*#△19.24±3.01*#△12.59±1.27*#12.36±1.34*#

表3 各组血浆中血浆AngII、ALD水平比较（μg/L，±s）

表3 各组血浆中血浆AngII、ALD水平比较（μg/L，±s）

组别假手术组模型组燧心低剂量组燧心中剂量组燧心高剂量组阳性药物组n 6 6 6 6 6 6 AngⅡ156.86±17.19 236.27±15.36*214.12±17.23*#△197.08±16.17*#183.93±18.21*#179.27±16.15*#ALD 231.91±18.13 372.18±20.31*295.11±24.19*#272.07±22.15*#264.71±20.26*#257.93±19.48*#

2.5 各组大鼠心肌组织NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表达比较

见图4，表4。与假手术组比较，模型组心肌组织NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达显著升高，SERCA2a、Bcl-2蛋白表达显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，燧心胶囊各组与阳性药物组NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达显著降低，SERCA2a、Bcl-2蛋白表达显著升高（P＜0.05）。与阳性药物组比较，燧心胶囊各剂量组NCX及燧心低、中剂量组Bax、Cleaved-Caspase3均显著升高，燧心胶囊各剂量组SERCA2a及燧心低、中剂量组Bcl-2显著降低（P＜0.05）。燧心胶囊各剂量组NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3比较差异具有统计学意义（F=52.138、46.654、4.037、32.860、19.629，P＜0.05），且NCX、Bax、Cleaved-Caspase-3随剂量增加呈下降趋势，SERCA2a、Bcl-2呈上升趋势。

图4 各组心肌组织NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表达

表4 各组大鼠心肌组织NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠心肌组织NCX、SERCA2a、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表达比较（±s）

组别假手术组模型组燧心低剂量组燧心中剂量组燧心高剂量组阳性药物组n 6 6 6 6 6 6 NCX 0.18±0.04 1.16±0.19*0.82±0.08*#△0.58±0.06*#△0.46±0.04*#△0.32±0.03*#SERCA2a 1.59±0.16 0.23±0.03*0.42±0.07*#△0.57±0.06*#△0.92±0.13*#△1.14±0.13*#Bax 0.88±0.13 2.36±0.29*1.59±0.34*#△1.36±0.15*#△1.22±0.12*#1.16±0.15*#Bcl-2 1.47±0.15 0.26±0.03*0.37±0.05#△0.53±0.11*#△0.86±0.14*#0.93±0.18*#Cleaved-Caspase-3 0.29±0.04 1.27±0.18*1.04±0.11*#△0.82±0.10*#△0.68±0.09*#0.60±0.04*#

3讨论

本研究采用左冠状动脉前降支结扎法复制心梗后心衰大鼠模型，组织学检测发现模型大鼠心肌梗死体积显著升高，心肌细胞变性、破裂、坏死，心肌纤维排列紊乱，组织伴有炎性细胞浸润，提示模型大鼠出现严重心肌损伤及心肌炎症反应，经超声检测发现模型大鼠心肌肥大，心脏收缩、舒张功能下降，符合心衰主要表现［10-11］，提示心梗后心力衰竭大鼠模型复制成功。本研究发现模型组大鼠血清中ALD、AngⅡ水平均升高，提示心力衰竭大鼠RAAS系统激活。

中医学认为心力衰竭主要为“心水”范畴，患者由心气虚弱发展为心阴虚、心阳虚，临床多表现为阳虚水泛，因此应以提升阳气、温阳利水法进行治疗。燧心胶囊主要由制附子、肉桂、黄芪、白芍等组成，其中黄芪为主药，具有补气升阳、利水消肿的功效；制附子、肉桂、当归、白芍为辅药，具有温通心阳、补益心血的功效；茯苓、猪苓为佐药，可化气行水、上敛肺气，下滋肾阴，且能引诸药入心经；全方具有温通心阳、化气行水的主要功效。临床研究显示慢性心衰患者给予燧心胶囊后，则能改善患者心功能，降低血清炎症反应，发挥抗心衰的效果［12］。本研究通过给予心力衰竭大鼠燧心胶囊干预后，发现大鼠心肌梗死体积显著降低，心肌组织损伤程度降低，心脏收缩、舒张能力升高，LVMI降低，血清ALD、AngⅡ水平降低，且高剂量干预组效果与卡托普利相当，提示燧心胶囊可通过抑制RAAS系统激活，提高心室收缩、舒张功能，进而保护心力衰竭大鼠心肌组织，然而其具体作用机制目前尚不清楚。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中凋亡相关基因，Bcl-2表达下调、Bax表达上调导致Bcl-2/Bax平衡失调，激活Caspase级联反应促进细胞凋亡［13］。本研究发现，给予燧心胶囊干预后，Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达显著降低，Bcl-2蛋白表达显著增加，提示燧心胶囊干预能通过降低心肌梗死引起的心肌细胞凋亡，从而发挥心肌保护作用。研究显示，增强NCX钠离子/钙离子交换活性可代偿SERCA2a对钙离子摄取功能的降低，进而增强心室收缩、舒张能力；而过度增强钠离子/钙离子交换活性则会使钙离子过度外排，SERCA2a摄取钙离子减少，造成心脏收缩功能降低［14］。因此NCX/SERCA2a在钙调节方面不协调，会导致细胞中钙离子稳态失衡，损伤心脏功能，这即是NCX/SERCA2a平衡假说。Rouhana等研究显示早期NCX/SERCA2a失衡与压力超负荷造成的心力衰竭有关［15］。本研究发现心力衰竭大鼠心肌组织中NCX蛋白表达升高，SERCA2a蛋白表达降低，而给予燧心胶囊干预后心肌组织中NCX蛋白表达降低，SERCA2a蛋白表达升高，且具有剂量依赖性，高剂量组与阳性药物组相当，提示燧心胶囊可通过恢复NCX/SERCA2a平衡，以维持细胞内钙离子稳态，从而发挥对心力衰竭大鼠心肌保护作用。

综上所述，燧心胶囊可通过改善NCX/SERCA2a平衡，促进肌浆网钙离子的摄取以及细胞中钙离子的泵出，增强心脏功能，降低心肌细胞凋亡，从而发挥对心力衰竭大鼠心肌的保护作用，然而心肌梗死后引发的心力衰竭过程极复杂，涉及的信号通路与调控蛋白还需进行深入研究，以期为疾病的治疗提供更充分的理论依据。