南葶苈子提取液对心肌缺血/再灌注大鼠心肌自噬及MAPK/ERK1/2通路的影响*

陈小兰 郑道国 徐群威 苏丽丽

（浙江省台州市中西医结合医院，浙江 台州 317523）

缺血性心脏病严重威胁人类健康，其发病率呈现增长趋势［1］。通过有效方法使缺血心肌重新获得血液供应可治疗缺血性心脏病，但是血液再灌注会加剧原有心肌缺血性损伤，即发生心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）［2］。近年来，中医药对MI/RI保护作用的研究是中西医结合研究的切入点之一，采用中药有效成分提取物或中药复方对于治疗MI/RI具有较好的疗效［3］。因此，系统地筛选能有效治疗该病的中草药，并研究其作用机制，可发掘传统中药方剂的临床实用价值，推动中药科学内涵的发展。南葶苈子是十字花科植物播娘蒿的干燥成熟种子，在临床中多用于治疗心力衰竭、肺水肿等疾病，疗效明显［4］。研究发现，南葶苈子提取液可改善心力衰竭大鼠各项心功能指标，保护心肌损伤［5］。目前，南葶苈子提取液对MI/RI发生时心肌自噬的影响还未见报道。本研究通过建立MI/RI大鼠模型，观察南葶苈子提取液对MI/RI大鼠心肌自噬的影响并探讨其可能的作用机制，以期为进一步地治疗相关心脏疾病的新药研发提供一定实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 72只健康成年雄性SD大鼠，SPF级，体质量160～240 g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。大鼠饲养条件：光照12 h，室温25～28℃，相对湿度45%，自由饮水和进食。

1.2 试药与仪器 南葶苈子水提液：取100 g南葶苈子，加入4倍量蒸馏水，70℃水浴提取3次，每次提取1 h，合并滤液浓缩至100 mL备用，每1毫升相当于2 g原生药，实验时用0.9%氯化钠注射液配成所需浓度。果糖二磷酸钠注射液，北京华靳制药有限公司，国药准字H20013086。乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。LC3Ⅰ和LC3Ⅱ抗体，美国Epitomics公司，货号分别为ab52768、ab51739。Beclin-1抗体，美国CST公司，货号D40C5。兔抗鼠B淋巴细胞瘤（Bcl-2）多克隆抗体（批号Nosc-509）。蛋白激酶p38（p38）抗体，美国CST公司，货号D31C7。细胞外信号调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）和p-ERK1/2抗体，美国Cell Signaling Technology，批号分别为SC365058、SC365062。β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。JEM-1011透射电子显微镜，日本。

1.3 分组与给药 大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为假手术组、模型组、阳性对照组及南葶苈子提取液低、中、高剂量组。阳性对照组，按剂量100 mg/kg尾静脉缓慢注射果糖二磷酸钠［5］。南葶苈子水提液低、中、高剂量组分别按剂量5、10、20 g/（kg·d）尾静脉缓慢注射南葶苈子水提液［6］。假手术组和模型组尾静脉注射100 mg/kg 0.9%氯化钠注射液。连续给药3周。

1.4 模型制备 末次给药结束后，参照文献方法建立MI/RI模型，大鼠于术前12 h禁食，麻醉后固定四肢，并切开气管与动物呼吸机相连接，逐步分离肌肉组织后找到冠状动脉左前降支，在分支起点约1～2 mm处采用5-0号丝线结扎，心电图中的ST段抬高、缺血心肌区域的心肌壁发绀、膨出，表明MI形成。结扎30 min后松开，将胸腔关闭再灌注120 min，心电图中的ST段回落＞1/2，表明MI/RI模型成功建立［7］。假手术组只开胸不结扎。

1.5 标本采集与检测 1）血清LDH、CK-MB和cTnⅠ检测。大鼠再灌注120 min后腹主动脉取血，4℃、3 000 r/min离心10 min，收集上清液-20℃保存备用。按照试剂盒说明检测上清液中CK-MB、LDH和cTnⅠ含量。2）心肌组织HE染色。大鼠取血后，迅速剪取心脏，预冷0.9%氯化钠注射液冲洗。取适量心肌组织固定于10%甲醛溶液中，经脱水、包埋制成石蜡切片，苏木精和伊红染色，光学显微镜观察。剩余心肌组织-80℃保存备用。3）心肌组织自噬小体观察。参照文献［8］方法，取心肌组织，2.5%戊二醛固定4 h，清洗后用锇酸固定2 h，经丙酮脱水、丙酮与包埋剂浸透、Epon 812树脂包埋，超薄切片。用醋酸铀、硝酸铅双染色20 min，透射电镜观察。4）心肌组织MDA和SOD检测。取心肌组织称质量，制成心肌组织匀浆，4℃、3 500 r/min离心15 min，收集上清液-20℃保存备用。按照试剂盒说明检测上清液中MDA和SOD含量。5）心肌组织蛋白检测。采用Western blotting法测定心肌组织Beclin-1、LC3Ⅱ、Bcl-2、p38和p-ERK1/2蛋白表达水平。取心肌组织剪碎，加入RIPA裂解液置于冰上充分裂解，离心取上清液，BCA法测定蛋白含量。取适量蛋白，加入上样缓冲液，100℃煮沸5 min后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将分离的蛋白质转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗4℃孵育过夜。洗膜后，加入二抗室温孵育1 h。经ECL发光显影后，以β-actin为内参，用SensiAnsys凝胶系统分析其灰度值。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（）表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料用n表示，采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组大鼠心电图比较 见图1，表1。与假手术组比，模型组大鼠心电图ST段抬高（P＜0.05）。与模型组比较，阳性对照组及南葶苈子提取液中、高剂量组大鼠心电图ST段降低（P＜0.05）。与阳性对照组比较，南葶苈子提取液低、中剂量组大鼠心电图ST段抬高（P＜0.05）。南葶苈子不同剂量组之间比较差异具有统计学意义（F=10.017，P＜0.05），心电图ST段随剂量增加呈下降趋势。

图1 各组大鼠心电图变化

表1 各组大鼠心电图ST段比较（mV，±s）

表1 各组大鼠心电图ST段比较（mV，±s）

与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，△P＜0.05。下同

组别假手术组模型组阳性对照组南葶苈子提取液低剂量组南葶苈子提取液中剂量组南葶苈子提取液高剂量组n 12 12 12 12 12 12 ST段0.18±0.05 0.57±0.11#0.31±0.07*0.49±0.10△0.41±0.09*△0.33±0.07*

2.2 各组大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比较 见表2。与假手术组比较，模型组大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高（P＜0.05）。与模型组比较，阳性对照组及南葶苈子提取液中、高剂量组大鼠血清LDH、CKMB和cTnⅠ均降低（P＜0.05）。与阳性对照组比较，南葶苈子提取液低、中剂量组大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高，且南葶苈子提取液高剂量组大鼠血清CK-MB降低（P＜0.05）。南葶苈子不同剂量组之间比较具有统计学意义（F=1596.089、1390.122、33.028，P＜0.05），血清LDH、CK-MB和cTnⅠ随剂量增加呈下降趋势。

表2 各组大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比较（±s）

表2 各组大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ比较（±s）

组 别n LDH（U/L）CK-MB（U/L）cTnⅠ（ng/L）假手术组模型组阳性对照组南葶苈子提取液低剂量组南葶苈子提取液中剂量组南葶苈子提取液高剂量组12 12 12 12 12 12 863.25±23.17 1 933.47±61.52#950.72±32.48*1 891.54±50.26△1 429.18±38.46*△947.62±31.93*1 539.17±40.28 3 769.24±133.57#1 765.29±43.85*3 659.26±128.46△2 573.18±81.92*△1 698.27±42.19*△27.35±3.68 68.29±11.59#32.85±3.91*60.19±10.25△47.28±7.93*△34.18±4.05*

2.3 各组心肌组织病理学变化 见图2。假手术中组心肌细胞大小均匀，边界清晰。模型组大鼠心肌坏死，出现水肿，中性粒细胞浸润，和轻度炎症，心肌细胞排列不规则，细胞间隙增大。阳性对照组心肌细胞排列规整，细胞界限较为清晰，染色均匀。经南葶苈子提取液干预后，随着剂量增加心肌病变缓解，坏死、炎症细胞浸润和心肌水肿明显减少，心肌细胞排列更为规整。

图2 心肌组织病理学变化（200倍）

2.4 心肌组织自噬小体观察 见图3。假手术组心肌细胞细胞膜完整，细胞器形态正常。模型组大鼠心肌组织线粒体肿胀，出现大量自噬小体，空泡变性严重。阳性对照组的自噬小体数量较少，且心肌细胞细胞膜较为完整。南葶苈子提取液组大鼠心肌组织随着剂量增加，线粒体肿胀程度不断减轻，自噬小体数量不断减少。

图3 各组心肌组织超微结构观察（400倍）

2.5 各组大鼠心肌组织MDA和SOD水平比较 见表3。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织MDA含量升高（P＜0.05），SOD活力降低（P＜0.05）。与模型组比较，阳性对照组及南葶苈子提取液中、高剂量组大鼠心肌组织MDA含量降低（P＜0.05），SOD活力升高（P＜0.05）。与阳性对照组比较，南葶苈子提取液低、中剂量组大鼠心肌组织MDA含量升高，SOD活力降低（P＜0.05）。南葶苈子不同剂量组之间比较具有统计学意义（F=395.481、322.516，P＜0.05），其中心肌组织MDA含量随剂量增加呈下降趋势，SOD活力随剂量增加呈上升趋势。

表3 各组大鼠心肌组织MDA和SOD水平比较（±s）

表3 各组大鼠心肌组织MDA和SOD水平比较（±s）

组别假手术组模型组阳性对照组南葶苈子提取液低剂量组南葶苈子提取液中剂量组南葶苈子提取液高剂量组n 12 12 12 12 12 12 MDA（nmol/mg）3.29±0.38 19.57±1.53#5.29±0.47*17.23±1.49△11.28±0.87*△5.41±0.45*SOD（U/mg）185.27±11.34 79.25±5.26#160.73±10.51*83.46±5.79*△128.71±7.18*△163.49±9.73*

2.6 各组自噬相关蛋白和MAPK/ERK1/2通路相关表达比较 见图4、表4。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（P＜0.05），Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表达降低（P＜0.05）。与模型组比较，阳性对照组及南葶苈子提取液中、高剂量组大鼠心肌组织Beclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P＜0.05），Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表达升高（P＜0.05）。与阳性对照组比较，南葶苈子提取液低剂量组Beclin-1、p38及南葶苈子提取液不同剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，南葶苈子提取液低剂量组Bcl-2及南葶苈子提取液低、中剂量组p-ERK1/2降低（P＜0.05），南葶苈子不同剂量组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-ERK1/2、p38之间比较差异具有统计学意义（F=21.977、82.006、39.661、23.607，P＜0.05），其中B-eclin-1、p38蛋白以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值随剂量增加呈下降趋势，p-ERK1/2蛋白表达随剂量增加呈上升趋势。

图4 自噬和MAPK/ERK1/2通路相关蛋白表达条带

表4 各组自噬和MAPK/ERK1/2通路相关蛋白相对表达水平比较（±s）

表4 各组自噬和MAPK/ERK1/2通路相关蛋白相对表达水平比较（±s）

组别假手术组模型组阳性对照组南葶苈子提取液低剂量组南葶苈子提取液中剂量组南葶苈子提取液高剂量组n 12 12 12 12 12 12 Beclin-1 0.34±0.12 1.09±0.27#0.45±0.18*0.98±0.26△0.53±0.21*0.43±0.17*LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.20±0.10 1.96±0.25#0.34±0.13*1.86±0.24△1.33±0.21*△0.74±.19*△Bcl-2 0.96±0.25 0.28±0.10#0.49±0.21*0.29±0.13△0.37±0.16*0.45±0.19*p-ERK1/2 0.91±0.23 0.18±0.08#0.87±0.21*0.23±0.09△0.43±0.17*△0.79±0.19*p38 0.28±0.11 0.85±0.21#0.34±0.13*0.81±0.20△0.42±0.17*0.37±0.14*

3讨论

MI/RI可增加心肌细胞膜通透性，导致心肌内细胞酶释放进入血液，因此，血清心肌酶可用于判断心肌损伤的严重程度［9］。血清LDH、CK-MB和CTnⅠ是临床上常用的心肌损伤标志物。本研究结果显示，MI/RI大鼠心电图ST段显著抬高，心肌组织细胞排列不整齐，出现水肿、炎症等现象，LDH、CK-MB和cTnⅠ均升高，说明MI/RI大鼠心肌细胞受到损伤。南葶苈子提取液干预后，心肌组织水肿、炎症等现象得到改善，LDH、CK-MB和cTnⅠ降低，说明其可减轻MI/RI对细胞膜的损伤，降低心肌酶释放，发挥心肌保护作用。

自噬是溶酶体降解细胞内部分细胞质、细胞器等过程的统称，可维持心肌细胞形态、结构和功能。心肌缺血再灌注引起机体产生氧化应激，氧化应激过程中生成的活性氧可诱导自噬产生［10］。氧化应激发生时，过量的氧自由基攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸使其脂质过氧化。MDA作为脂质过氧化产物，其含量越高，说明心肌组织损伤越严重。SOD是重要的抗氧化酶，可有效清除自由基，减轻自由基对心肌细胞或组织的损伤。本研究结果显示，南葶苈子提取液可降低MI/RI大鼠心肌组织MDA含量，提高SOD活力，提示南葶苈子提取液可通过降低氧化应激减轻自噬对MI/RI大鼠心肌损伤。Beclin-1在自噬过程中发挥关键的调节作用，其水平高低可反映自噬活性［11］。抗凋亡蛋白Bcl-2可与Beclin-1结合调控机体自噬水平［12］。细胞自噬发生过程中，LC3Ⅰ被剪切为LC3Ⅱ，LC3Ⅱ参与细胞自噬泡的形成，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬被激活的程度［13］。本研究结果显示，南葶苈子提取液干预可降低MI/RI大鼠心肌组织自噬小体数量，Beclin-1蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，促进Bcl-2蛋白表达，提示南葶苈子提取液可通过降低MI/RI大鼠心肌自噬，减轻心肌损伤。

缺血/再灌注过程引起心肌细胞凋亡。丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路（MAPKs）是重要的细胞凋亡调控通路，主要包括p38和ERK1/2等通路。p38通路的激活促进细胞凋亡，而ERK1/2信号通路的激活可抑制细胞凋亡，增加调控。p38和ERK1/2信号通路参与心肌缺血/再灌注过程，影响心肌组织正常功能［14］。本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织p38蛋白水平升高，p-ERK1/2蛋白水平降低，与相关报道结果一致［15］。南葶苈子提取液干预后，p38蛋白随剂量增加呈下降趋势，p-ERK1/2蛋白表达随剂量增加呈上升趋势，提示南葶苈子提取液可能通过作用p38和ERK1/2信号通路减轻MI/RI。

综上所述，南葶苈子提取液可减轻心肌缺血/再灌注大鼠心肌自噬，保护心肌损伤，其作用机制可能与p38和ERK1/2信号通路有关。