多成分含量测定结合高效液相色谱指纹图谱评价不同产地大青叶药材质量

李 媛，张苗苗，张 鑫，张 楠，谢志民

（陕西省西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054）

大青叶为十字花科植物菘蓝 Isatis indigotica Fort.的干燥叶，产于河北、江苏、浙江、安徽、河南、湖北、甘肃等地，性味苦寒，归心经、胃经，具有清热解毒、凉血消斑的功效[1]，以及抗病毒[2]、抗内毒素[3]和抑菌[4]等活性，临床用于各种病毒性流行性感冒、乙型脑炎、单纯疱疹病毒性角膜炎、流行性腮腺炎和病毒性肝炎等传染性疾病的治疗[5]。大青叶化学成分以生物碱类为主，包括靛蓝、靛玉红等吲哚类和4（3H）喹唑酮、4-羟基喹唑啉、2，4-羟基喹唑啉、色胺酮等喹唑酮类生物碱，此外还含有丁香酸、水杨酸等有机酸类[6]。采用单一指标性成分的含量进行中药材质量控制存在一定缺陷[7-10]。指纹图谱能全面表征药材内在的化学成分种类和数量，可综合反映和有效控制药材整体质量[11-12]。借助色谱技术，可得到其化学成分的色谱图，具有特征强、信息量大和整体性强的特点，已成为国际公认的控制中药或天然药材质量的有效手段[13-14]。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定大青叶中4-羟基喹唑啉、2，4-羟基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛蓝和靛玉红6种有效成分，并建立大青叶的指纹图谱，能有效评价和控制药材质量，可为完善大青叶质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BT25S型，BT124S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 试药

甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；娃哈哈纯净水；4-羟基喹唑啉（批号为 A83DC-NR，含量 ＞98.0%）和2，4-羟基喹唑啉（批号为 I8ZKG-TO，含量 ＞98.0%）均由梯希爱（上海）化成工业发展有限公司提供；丁香酸（Sigma-Aldrich，批号为 BCBS3754V，含量≥98.0% ），色胺酮（Toronto research chemicals INC，批号为T947000，含量为 98.0% ），靛蓝（批号为 110716-200610），靛玉红（批号为0717-200003），均由中国食品药品检定研究院提供；10批大青叶药材分别购自甘肃（S2，S10）、安徽（S1，S4，S6-S9，）、河北（S3）、江苏（S5），经西安市食品药品检验所中药室谢志民主任药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Shimadzu Shim-pack GIST C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱温：35 ℃ ；检测波长：(0～29 min)225 nm，(29～85 min)254 nm；分析时间：85 min；进样量：10 μL；流动相：甲醇（A） -0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脱条件见表 1；流速：1.0 mL ／min。在此色谱条件下的色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱条件

图1 高效液相色谱图

2.1.2 溶液制备

取 4-羟基喹唑啉 10.32 mg，2，4-羟基喹唑啉5.20 mg，丁香酸 8.60 mg，精密称定，置同一 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液Ⅰ；分别取色胺酮 5.02 mg，靛蓝 5.31 mg，靛玉红 15.0 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，然后精密量取上述对照品贮备液Ⅰ1 mL，加氯仿10 mL超声溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液Ⅱ。其中，4-羟基喹唑啉、2，4-羟基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛蓝和靛玉红质量浓度分别为 41.28，20.80，34.40，200.80，212.40，600 μg ／mL。取大青叶粉末约 3 g，精密称定，置平底烧瓶中，加入50 mL氯仿，摇匀，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，加氯仿补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液浓缩至尽干，用甲醇-氯仿（8∶2）转移定容至10 mL容量瓶，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取对照品贮备液Ⅱ0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，置 25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度。按拟订色谱条件进样，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程。结果见表2。

表2 各成分回归方程与线性范围(n＝5)

精密度试验：按拟订色谱条件，精密量取对照品溶液 10 μL，连续进样 6次，测定峰面积。结果 4-羟基喹唑啉、2，4-羟基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛蓝和靛玉红峰面积的 RSD分别为 0.64%，0.67%，0.65%，0.58%，0.66%，0.32%(n ＝ 6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品S3粉末3 g，精密称定，依法制备供试品溶液，在拟订色谱条件下分别于 0，2，4，8，12，24 h时测定峰面积。结果4-羟基喹唑啉、2，4-羟基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛蓝和靛玉红峰面积的 RSD分别为1.52% ，1.64% ，1.72% ，0.92% ，0.87% ，0.53%(n＝6)，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品S3粉末，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果4-羟基喹唑啉、2，4-羟基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛蓝和靛玉红含量的 RSD 分别为 1.81% ，1.62% ，1.43% ，0.76% ，0.65%，0.48%(n ＝ 6)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品S3粉末1.5 g，精密称定，共6份，每份加入相同量（为已知含量的100%）的4-羟基喹唑啉、2，4-羟基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛蓝和靛玉红对照品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，计算加样回收率。结果见表3。

表3 各成分加样回收试验结果（n＝6）

2.1.4 样品含量测定

分别取10批大青叶粉末各3 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，计算含量。结果见表4。

2.2 聚类分析

采用SPSS 20.0统计学软件，对10批大青叶药材中6种成分含量进行系统聚类，采用组间联接法，平方欧式距离为区间，得到10批药材的聚类分析图，详见图2。不同产地大青叶药材含量差异较大，同一类含量差异较小。

表4 样品各成分含量测定结果（ g／g）

图2 10批大青叶药材系统聚类分析

2.3 指纹图谱建立

2.3.1 色谱条件

同 2.1.1项下色谱条件。

2.3.2 方法学考察

精密度试验：取同一批样品S3粉末，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，以4号峰（色胺酮）的保留时间和峰面积为参照。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD分别在0.35%和0.94%以内(n＝6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样S3粉末3 g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于 0，2，4，8，12，24 h时测定峰面积。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD分别在 0.46%和 1.73%以内(n＝6)，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品S3粉末，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD分别在0.62%和2.91%以内(n＝6)，表明方法重复性良好。

2.3.3 不同产地大青叶指纹图谱建立

分别精密称取10批大青叶样品粉末，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，得10批样品图谱。采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件分析，以中位数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.5 min，根据匹配结果确定了大青叶共有峰为15个。由于4号峰（色胺酮）较稳定，且与邻近峰基本可达到基线分离，因此选择此峰作为参照峰。10批大青叶的指纹图谱与对照图谱的相似度均在0.90以上。结果见图3及表5。

图3 10批大青叶的指纹图谱

表5 10批样品相似度结果

3 讨论

考察了超声提取、加热回流提取2种方法对各成分的影响，结果采用加热回流得到色谱峰个数和峰面积均较多，故选择此方法提取；又采用了甲醇、甲醇-氯仿不同比例、二氯甲烷、氯仿等不同溶剂进行加热回流提取，结果采用氯仿提取得到的各成分含量均较高，故确定为氯仿加热回流提取。

考察了甲醇 -水、乙腈-水、甲醇 -0.1%磷酸溶液，最终确定甲醇-0.1%磷酸溶液及文中梯度洗脱方法，色谱图中各成分分离效果最佳。4-羟基喹唑啉最大吸收波长为225 nm，靛蓝和靛玉红2015年版《中国药典(一部)》方法波长为 606 nm和 289 nm[15]，为兼顾各成分的响应值，故采用变换波长的方法。

10批大青叶靛玉红的含量均高于0.020%，质量符合2015年版《中国药典(一部)》规定。但其他成分的含量差异较大，尤其是4-羟基喹唑啉和2，4-羟基喹唑啉。不同产地大青叶各成分含量差异较大，4个产地的吲哚类生物碱含量相当，而甘肃和河北产地的喹唑酮类生物碱含量相对较高，表明其地域影响明显。同一产地的大青叶各成分含量也有差异，而已有文献表明不同采收期会引起大青叶中靛玉红含量差异明显，头刀叶含量大于二刀叶[16]，表明不同采收时间对大青叶中6种成分含量影响也较大，故使用和评价大青叶的质量时应考虑其产地和采收期的影响。

相似度考察结果表明，10批大青叶HPLC指纹图谱相似度较高，均超过0.9，说明药材成分构成基本一致，药材质量稳定；聚类分析结果将10批大青叶药材聚为4类，说明不同产地的同种药材之间存在一定差异。

HPLC法测定大青叶中6种成分的含量，以及建立指纹图谱和聚类分析相结合的方法，不同于2015年版《中国药典(一部)》方法的单成分指标控制，能更全面、准确地判别药材的优劣，可有效用于大青叶药材的质量控制与鉴定。