混合血小板裂解液对人骨髓间充质干细胞原代培养、增殖和成骨分化的影响

徐杨 林飞跃 尹晓明

[摘要]目的 研究混合血小板裂解液（pHPL）对体外培养的人骨髓间充质干细胞（hBMMSCs）原代培养、增殖和成骨分化的影响。方法 使用临床过期的多份浓缩血小板混合，多次冻融激活后制备pHPL，分别使用胎牛血清（FBS）和pHPL加基础培养液原代培养hBMMSCs，比较两组中的细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期和增殖率，并在加入经典成骨诱导液后检测两组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量和矿化结节形成，比较其成骨分化能力。结果 FBS和pHPL培养组均能较好地支持hBMMSCs的原代培养，两组中细胞形態、表面标志物、细胞骨架、细胞周期均无明显差异，但pHPL组在5、7 d时的细胞增殖率明显高于FBS组（P<0.05）;在成骨诱导后，pHPL组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量也明显高于FBS组（P<0.05），两组中细胞均可以形成成熟的矿化结节。结论 pHPL能够很好支持hBMMSCs的原代培养、增殖和成骨分化，且较FBS能更好地促进其增殖和成骨分化。

[关键词]人血小板裂解液;骨髓间充质干细胞;原代培养;增殖;成骨分化

[中图分类号] R722.12          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）6（c）-0013-06

[Abstract] Objective To investigate the effect of pooled human platelet lysate in supporting human bone marrow mesenchymal stem cells for primary culture， propagation and osteogenic differentiation. Methods Multiple outdated platelet concentrates were pooled together. Then pHPL was made after repeated freeze/thaw cycles to activate the platelet. Either pHPL or FBS was used as medium supplement plus basic culture media for primary culture of human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell morphology， surface marker expression， Cytoskeleton， growing circle， growth curve and osteogenic markers including ALP level， gene expression and formation of calcified nodules after induction with classic mineralized solution were compared between the two groups. Results There were no difference between the two groups in cell morphology， surface marker expression， cytoskeleton and growing circle. Cell growth rate in pHPL group was much higher than FBS group at 5 and 7 d （P<0.05）. Also ALP level and osteogenic markers gene expression in pHPL group were higher than FBS group （P<0.05）. Formation of mature calcified nodules was observed in both groups. Conclusion pHPL can support hBMMSCs for primary culture， propagation and osteogenic differentiation， and it is better to promote their propagation and osteogenic differentiation than FBS.

[Key words] Human platelet lysate; Bone marrow mesenchymal stem cells; Primary culture; Propagation; Osteogenic differentiation

组织工程和细胞治疗应用中，特定种子细胞在体外适宜条件下的培养、扩增乃至诱导分化是其中非常关键的一个环节[1]。既往人体细胞的体外培养均有赖于添加了胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的培养基。虽然其能够较好地支持细胞的生长和分化，但由于其含有异种蛋白，使得培养后的细胞回植人体可能存在难以预料的风险，这也是实现临床应用的最大障碍之一[2]。寻找FBS的替代品，建立质量稳定可控的体外培养体系一直是研究的热点。本研究使用混合异体血小板裂解液（pooled human platelet lysate，pHPL）代替FBS，研究其对人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs）原代培养、增殖和分化的影响，现报道如下。

1材料与方法

1.1 pHPL的制备

福建省血液中心采用富血小板血浆法制备的5袋浓缩血小板，超过储存时间而不能用于临床输注。浓缩血小板于-30℃冷冻24 h，37℃解冻，混合解冻后的浓缩血小板，并分装在50 ml离心管内，重复冻融过程一次，获得激活的pHPL，-30℃冷冻保存。使用时取分装的pHPL解冻，4℃ 4000 r/min离心15 min，去除碎裂的细胞组织，吸取上清，按体积比10%加入DMEM-LG培养液中备用。本研究获得福建省立医院医学伦理委员会批准，于2017年1月～2019年3月在福建省立医院中心实验室完成。

1.2 hBMMSCs的分离和培养

选取临床上因为退变性疾病需要取髂骨植骨的患者，排除感染性和肿瘤性病变患者。术前获得患者及家属知情同意。术中抽取骨髓10～15 ml，通过密度梯度离心法分离hBMMSCs。细胞计数后，以1×107个/ml的密度等量接种于A组：10%FBS（PAN biotech，德国）+DMEM-LG培养液（Gibco，美国）和B组：10%pHPL+ DMEM-LG培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度下进行培养。24 h半量换液，48 h全量换液，以后每3天换液，待细胞生长至80%～90%时传代，取第2～4代细胞实验。

1.3方法

1.3.1倒置显微镜观察细胞形态

倒置显微镜逐日观察两组细胞的生长情况和形态特征。

1.3.2 hBMMSCs表面标志物的检测

两组均取第3代细胞，0.25%胰酶消化采集细胞，PBS洗涤计数后重悬，密度3×106个/ml，取细胞悬液100 μl，加入鼠PE标记的单克隆抗体CD29、CD44、CD105、CD14、CD90（eBlosdence，美国）各20 μl，并以鼠PE标记的IgG1作为同型固定阴性对照，充分混匀，室温避光半小时。上流式细胞仪进行检测，并用CellQuest软件分析结果。

1.3.3细胞骨架免疫荧光染色

取第3代细胞，胰酶消化重悬后，以1×105个/ml的密度接种于12孔板，分别使用2种培养基培养48 h后，吸弃旧培养液，用预温PBS（37℃）清洗细胞。4%多聚甲醛室温固定10 min，用0.1% Triton X-100/PBS室温破膜5 min。5 μl FITC-Phalloidin（联科生物，中国）贮存液加入150 μl PBS中配成工作液（5 μg/ml）并用以染色细胞，室温染色60 min。PBS清洗后加荧光封片液封片，倒置荧光显微镜下观察细胞骨架系统，并用ImageJ软件测量细胞的长度和宽度，计算长/宽比。

1.3.4细胞周期分析

取第3代細胞，消化重悬后以5×103个/ml的密度接种于24孔板内，分别加入两种培养基，每组3个复孔。培养24 h后，胰酶消化采集细胞，以5×105个/ml的密度重悬于1 ml PBS中并反复振荡形成单细胞悬液。加入2 ml冷无水乙醇，迅速混匀后4℃过夜固定细胞。用100 mg/ml PI（吉凯，中国）在4℃染色30 min。上流式细胞仪检测，应用Modifit软件分析。计算G0/G1期、S期和G2期的细胞百分比。

1.3.5细胞增殖率测定

取第3代细胞，消化重悬后以3×105个/ml的密度接种于96孔板中。边缘孔用无菌水填充。在培养到一定的时间（1、3、5、7 d）时，向每孔加入10 μl CCK 8溶液（日本同仁），将培养板置于培养箱内孵育2 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，检测细胞增殖率并绘制细胞生长曲线。

1.3.6 hBMMSCs向成骨方向诱导

分别在A、B组中培养液内加入经典成骨诱导液（10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10-8 mol/L 地塞米松、50 mg/L L-抗坏血酸）诱导其向成骨方向分化。

1.3.6.1碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）检测  将hBMMSCs细胞悬液以5×103个/ml的浓度接种于24孔板内，分别加入两种培养基，每组3复孔。48 h后加入成骨诱导液继续培养。在诱导后第2、6、10、14、18天进行检测。吸出旧培养基，每孔加入300 μl 0.2% Triton X-100，4℃冰箱过夜，采用ALP检测试剂盒（碧云天，中国），检测ALP含量。

1.3.6.2成骨相关基因检测  以2×104个/ml的密度将细胞接种于24孔板内，分别使用含有成骨诱导液的2种培养基培养10 d。到时间后，用TRIzol（Invitrogen，美国）溶解细胞，收集细胞内总RNA。将细胞集合到一起以获得足够的RNA量。每组等量的总RNA用Superscript Ⅱ first-strand cDNA试剂盒（Invitrogen，美国）反转录为cDNA。引物的设计根据RUNX2、ALP、Ⅰ型胶原（COLⅠ）和骨钙素（Osteocalcin，OC）的核苷酸序列进行，利用引物设计软件PrimerPrimer 5设计（表1），靶基因的表达水平用持家基因GAPDH的水平作标准化，使用荧光定量PCR（real time PCR）法检测成骨相关基因含量。

1.3.6.3矿化结节茜素红染色  以5×103个/ml的密度分接种于24孔板内，分别加入两种培养基。48 h后加入成骨诱导液继续培养至14 d，吸出旧培养基，PBS缓冲液清洗3遍，体积分数75%乙醇固定10 min，采用莤素红染色的方法检测矿化结节，染色完成后，用蒸馏水反复漂洗至不再脱色，显微镜检并拍照。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。