玻璃珠破碎法制备重组人CYP2C9酵母微粒体的条件优化

吴跃章 Zeinab Abdelrahaman 千文 池田胜也 杨长青

[摘要]目的 通过优化玻璃珠破碎法的条件，制备最具活性的重组人CYP2C9酵母微粒体，从而为建立更加灵敏快捷的体外代谢筛选模型提供依据。方法 利用玻璃珠破碎的方法，制备重组人CYP2C9酵母微粒体。通过改变涡旋振荡次数和玻璃珠用量，优化制备微粒体的条件。用Lowry法测定微粒体中的蛋白含量，用CYP2C9的典型底物双氯芬酸与微粒体进行反应，以单位时间（h）内单位蛋白（mg/ml）所对应的双氯芬酸代谢物4-羟基双氯芬酸的生成量来确定微粒体的蛋白活性。结果 随着涡旋振荡次数和玻璃珠用量的增加，所制备微粒体蛋白的含量增加。当涡旋振荡次数为30次（每次涡旋振荡30 s，冷却60 s），玻璃珠用量为0.75 g时，代谢物生成量和单位时间单位蛋白所对应代谢物生成量最大，分别为1.21 μg和0.06 μg/[（mg/ml）·h]。结论 玻璃珠破碎法制备重组人CYP2C9酵母微粒体的最佳条件为涡旋振荡30次（每次涡旋振荡30 s，冷却60 s）和0.75 g玻璃珠。

[关键词]重组人CYP2C9酵母;微粒体;玻璃珠;双氯芬酸

[中图分类号] R969.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）6（c）-0008-06

[Abstract] Objective To prepare the most active recombinant human CYP2C9 yeast microsomes by optimizing the conditions of glass bead crushing method， thus provide and establish more sensitive and rapid in vitro metabolic screening model with the minimum metabolic content degradation. Methods Recombinant CYP2C9 human microsomes content was prepared by glass bead crushing method. By changing the number of vortex oscillations and the amount of glass beads， the conditions of preparing microspheres were optimized. Lowry method was used to determine protein and metabolite concentration in microsomes. The reaction with microsomes was carried out using Diclofenac， which was a typical substrate for 2C9 microsomes. The protein activity of microsomes was determined by the yield of diclofenac metabolite （4-hydroxy diclofenac） corresponding to unit protein （mg/ml） per unit time （h）. Results With the increase of the number of vortex oscillations and the amount of glass beads， the content of the prepared microsomal protein increased. When the number of vortices oscillated 30 times （30 s per vortex oscillation， 60 s of cooling） and the amount of glass beads was 0.75 g， the metabolite production and the corresponding metabolite production per unit of protein per unit of time were the largest， 1.21 μg and 0.06 μg/[（mg/ml）·h] respectively. Conclusion The optimal condition for preparation of recombinant human CYP2C9 yeast microsomes with minimum content degradation using glass beads lysis process was 30 cycle consist of （30 s per vortex oscillation， 60 s of cooling） and amount of 0.75 g glass beads.

[Key words] Recombinant human CYP2C9 yeast; Microsomes; Glass beads; Diclofenac

基因重組酵母是一种利用基因重组技术，将外源目的基因转录至酵母细胞中，使之表达相应蛋白的酵母[1-3]。重组人代谢酶酵母能够表达人肝微粒中不同亚型的CYP450酶[4]，与其他表达系统（如大肠埃希菌[4-5]、哺乳动物细胞[6]和昆虫细胞[7]等）相比，具有重组酶表达量和催化活性相对较高、生产周期短以及适合于大批量制备药物代谢物等[8]优点，因而具有突出优势。Dragan等[9]通过重组人CYP2C9酵母全细胞反应体系，制备了双氯芬酸的代谢物，但是不同药物的化学结构及理化性质各不相同，因此利用重组人CYP450酵母全细胞反应体系进行不同药物代谢途径及代谢物的筛选仍存在一定困难。

酵母是最简单的真核生物之一，含有与哺乳动物细胞类似的细胞器[10-11]。通过组织匀浆和差速离心的方法[12]，可以制备动物肝微粒体，同样，破碎酵母细胞也能够制备酵母微粒体[13]。利用重组人CYP450酵母微粒体对药物的代谢途径及代谢物进行筛选，可以消除酵母细胞本身（主要是细胞壁）[14-15]的干扰，使筛选结果更接近于人体。因此通过优化破碎方法制备最具活性的酵母微粒体，对微粒体反应体系灵敏度的提升具有重要意义。

本研究以重组人CYP2C9酵母为研究对象，以CYP2C9典型底物双氯芬酸的代谢物的生成量及单位时间（h）内单位蛋白（mg/ml）所生成的代谢物量为指标，通过改变涡旋振荡次数和玻璃珠用量，探讨玻璃珠破碎法制备酵母微粒体的最优条件，现报道如下。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器

LC-2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津公司）;涡旋振荡器XW-80A（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;玻璃珠（美国Biospec公司，直径为0.5 mm）;48孔板（无锡耐思生物科技有限公司）。

1.1.2试剂

重组人CYP2C9酵母、未转染酵母和4-羟基双氯芬酸（纯度≥98.0%）由南京珼瑞斯生物医药科技有限公司提供。还原型酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生系统试剂购自汇智泰康生物技术（北京）有限公司。Lowry蛋白浓度测定试剂盒、Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids和PMSF购自北京索莱宝科技有限公司。双氯芬酸标准品（纯度≥98%）和L-Histidine购自东京化成工业株式会社（TCI）。Leu Minus media购自北京泛基诺科技有限公司。Yeast Extract和Tryptone购自英国Oxoid公司。葡萄糖和DL-二硫苏糖醇（DTT）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。三氟乙酸（分析纯）和二水合EDTA二钠购自南京化学试剂股份有限公司。蔗糖购自西陇科学股份有限公司。琼脂粉购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1玻璃珠预处理

玻璃珠用浓盐酸浸泡24 h，滤去浓盐酸，用去离子水洗涤至中性，在60℃烘箱中干燥16 h，于4℃保存。使用前，将预处理后的玻璃珠置于冰上备用。

1.2.2未转染酵母菌和重组人CYP2C9酵母菌的培养

1.2.2.1 SD-His培养基（g/L）  Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids 6.7，L-Histidine 0.02，葡萄糖20，琼脂粉20（制备固体培养基时添加）。使用前，于115℃灭菌30 min，葡萄糖配制成20%溶液单独灭菌。

1.2.2.2 YPD培养基（g/L）  Yeast Extract 10，Tryptone 20，葡萄糖20，琼脂粉20（制备固体培养基时添加）。使用前，于115℃灭菌30 min，葡萄糖配制成20%溶液单独灭菌。

1.2.2.3未转染酵母菌培养流程  将甘油中保存的未转染酵母菌接种至YPD固体培养基上，放置生化培养箱中培养3 d（30℃）。3 d后取16个单颗菌落（直径≥2 mm），转移至含有1400 ml YPD培养基的2 L三角培养瓶中，培养3 d（30℃，200 r/min）。离心称重，按照菌重与培养基体积比1∶1加入YPD培养基，于4℃保存备用。

1.2.2.4重组人CYP2C9酵母培养流程  将甘油中保存的重组人CYP2C9酵母菌接种至SD-His固体培养基上，放置培养箱中培养5 d（30℃）。5 d后取16个单颗菌落（直径≥2 mm），转移到含有200 ml SD-His液体培养基的500 ml三角培养瓶中，培养40～48 h（30℃、200 r/min）。40～48 h后将培养基全部转移至2 L的三角培养瓶中，并加入1400 ml YPD培养基，培养2 d（30℃、200 r/min）。离心称重，按照菌重与培养基体积比1∶1加入SD-His培养基，于4℃保存备用。

1.2.3未转染酵母微粒体和重组人CYP2C9酵母微粒体的制备

1.2.3.1酵母微粒体缓冲液的制备  10%蔗糖，0.1 mol/L pH 7.4磷酸钾缓冲液，0.1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA（临用前加入1 mmol/L PMSF）。

1.2.3.2未转染酵母微粒体的制备  取所培养未转染酵母菌菌液5 ml（约含酵母菌2.5 g），离心除去YPD培养基，按菌重与缓冲液体积比1∶1加入酵母微粒体缓冲液，涡旋使之充分混悬。将混悬液分装入2 ml EP管中，使得每个EP管中含有1 ml混悬液（约含酵母菌0.5 g），并分别加入0.5 g玻璃珠，在涡旋振荡器上涡旋振荡30次（每次涡旋振荡30 s，冰上冷却60 s），离心（1000 g，10 min）取上清，再次离心（5000 g，1 h）取上清，上清即为未转染酵母微粒体混悬液[16]。于-20℃保存。

1.2.3.3重组人CYP2C9酵母微粒体的制备  取培养的重组人CYP2C9酵母菌菌液20 ml（约含酵母菌10 g），加入含有200 ml SD-His培养基的500 ml三角培养瓶中复苏2 d（30℃，200 r/min）。离心除去SD-His培养基，按菌重与缓冲液体积比1∶1加入酵母微粒体缓冲液，涡旋使之充分混悬。将混悬液分装入2 ml EP管中，使得每個EP管中含有1 ml混悬液（约含酵母菌0.5 g），并分别加入不同量的玻璃珠，在涡旋振荡器上涡旋振荡不同次数，离心（1000 g，10 min）取上清，再次离心（5000 g，1 h）取上清，上清即为重组人CYP2C9酵母微粒体混悬液[16]。玻璃珠用量分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g，涡旋振荡次数分别为10、20、30、40、50、60、70次（每次涡旋振荡30 s，冰上冷却60 s）。涡旋振荡次数和玻璃珠用量的默认值分别为30次和0.5 g。

1.2.4重组人CYP2C9酵母微粒体中蛋白含量的测定

利用Lowry蛋白浓度测定试剂盒及分光光度计，测定不同浓度的BSA蛋白标准品的A650值，制备标准曲线。利用标准曲线计算所制备重组人CYP2C9酵母微粒体混悬液中的蛋白含量。操作步骤参照Lowry法蛋白浓度测定试剂盒说明书[17]。

1.2.5重组人CYP2C9酵母微粒体蛋白活性的测定

在模拟体内环境下，利用CYP2C9典型底物双氯芬酸的代谢反应，来验证所制备酵母微粒体的蛋白活性，并利用双氯芬酸经CYP2C9代谢的代谢物4-羟基双氯芬酸的生成量，来量化不同制备条件下所制备的微粒体蛋白活性。

酵母微粒体反应在48孔板中进行，每孔加入不同条件制备的重组人CYP2C9酵母微粒体356 μl及NADPH再生系统A液（NADP+ 26.1 mmol/L，6磷酸葡萄糖66.0 mmol/L，氯化镁66.0mmol/L）20 μl和B液（6磷酸葡萄糖脱氢酶40 U/ml）4 μl，预温孵10 min。加入20 μl底物双氯芬酸进行反应，底物终浓度为25 μmol/L。

不同条件制备的微粒体各设置三组（n=3），同时设置对照组（未转染酵母微粒体组）。反应在37℃摇床中进行，分别于0 h和1 h取样100 μl，加入500 μl冰乙酸乙酯中进行淬灭反应，同时加入10 μl 30 μg/ml内标卡马西平。涡旋振荡3 min，离心取上清400 μl，吹干，并用100 μl甲醇复溶，用HPLC法测定复溶液中4-羟基双氯芬酸的峰面积，并根据标准曲线计算重组人CYP2C9酵母微粒体反应体系中4-羟基双氯芬酸的生成量。

1.2.6 HPLC色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-SP液相色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流动相：乙腈∶水∶三氟乙酸=51∶49∶0.1;流速：1.0 ml/min;检测波长：280 nm;柱温：30℃;进样量：10 μl。

2结果

2.1利用HPLC测定酵母微粒体反应体系中双氯芬酸及其代谢物的含量

图1是重组人CYP2C9酵母微粒体（制备条件为涡旋振荡30次，0.5 g玻璃珠）反应0 h和1 h样品及未转染酵母微粒体反应0 h和1 h样品的HPLC检测结果色谱图。双氯芬酸、代谢物4-羟基双氯芬酸及内标卡马西平在“1.2.6”项的HPLC色谱条件下分离度良好，保留时间分别为11.08 min、5.13 min和3.74 min。

仅在重组人CYP2C9酵母微粒体反应1 h的样品HPLC图谱中发现双氯芬酸代谢物4-羟基双氯芬酸的色谱峰，而其他样品的HPLC图谱中未出现此峰。

2.2涡旋振荡次数对重组人CYP2C9酵母微粒体蛋白活性的影响

探讨涡旋振荡次数对所制备微粒体蛋白活性的影响时，玻璃珠的用量为0.5 g。随着涡旋振荡次数的增加，所制备酵母微粒体蛋白含量呈增加趋势，在涡旋振荡次数为50次时，蛋白含量趋于稳定，约为22.49 mg/ml。代谢物4-羟基双氯芬酸的生成量在涡旋振荡次数为30次时最大，为1.82 μg（，且单位时间单位蛋白所生成的代谢物量也最大，为0.10 μg/[（mg/ml）·h]，随后都呈下降趋势。

2.3玻璃珠用量对重组人CYP2C9酵母微粒体蛋白活性的影响

探讨玻璃珠用量对所制备微粒体蛋白活性的影响时，涡旋振荡次数为30次。随着玻璃珠用量的增加，所制备酵母微粒体蛋白含量呈增加趋势，但不明显，玻璃珠量为0.75 g时，蛋白含量趋于稳定，为19.2 mg/ml。代谢物4-羟基双氯芬酸的生成量在玻璃珠量为0.75 g时最大，为1.21 μg，单位时间单位蛋白所生成的代谢物量在玻璃珠量为0.5 g和0.75 g时最大，均为0.06 μg/[（mg/ml）·h]。

3讨论

酵母细胞壁厚实[18]，影响胞内外物质的接触，因此细胞破壁对提高酵母利用率非常重要。目前常用的酵母破壁方法有酶解法[19]、超声波破碎法[20]、匀浆破碎法[21]和玻璃珠破碎法[22]等，其中玻璃珠破碎法具有操作简单，可以同时处理多个样品，且对酶活力和环境的损害较小等优点[23]。Donnell等[24]比较了玻璃匀浆器、珠磨机、超声破碎和玻璃珠涡旋振荡等7种破碎荚膜葡萄球菌酵母细胞壁提取锌金属蛋白的方法，结果表明玻璃珠涡旋振荡的方法对提取锌金属蛋白最有利，蛋白变性量最小。制备重组人代谢酶酵母微粒体通常也是采用玻璃珠涡旋振荡的方法[13-16]。为了保留较强的蛋白活性，避免微粒体蛋白因长时间涡旋振荡产热而失活，本研究采用涡旋振荡30 s，冰上冷却60 s的方式，重复多次涡旋振荡。研究结果显示，所有不同条件制备的重组人CYP2C9酵母微粒体蛋白均具有一定的活性。

研究结果显示，随着涡旋振荡次数的增加，所制备微粒体总量呈现饱和性，当涡旋振荡次数为40次以上时，接近饱和值。而酶活力在涡旋振荡次数为30次时出现峰值，随后显著下降，这与卢俊文等[25]的研究结果相似，笔者认为可能是因为涡旋振荡30次以后，微粒体总量趋于饱和，此时玻璃珠除了破碎酵母细胞，还会破碎已制备的微粒体细胞。而涡旋振荡次数为最佳值30次时，除了0.25 g以外，玻璃珠用量对所制备微粒体总量无明显影响，酶活性在玻璃珠用量為0.5 g和0.75 g时出现峰值。因为玻璃珠用量为0.75 g时，代谢物的生成量较高，因此玻璃珠用量为0.75 g时的破碎效果最佳。当玻璃珠量大于0.75 g时，酶活性显著下降，笔者认为可能是玻璃珠过量破碎了微粒体，使蛋白部分失活所致。

综上所述，玻璃珠破碎法制备酵母微粒体的最佳条件为涡旋振荡30次（每次涡旋振荡30 s，冷却60 s）和0.75 g玻璃珠。本研究结果将为建立更加灵敏快捷的体外代谢筛选模型提供依据。