基于形态与分子技术相结合的叶螨鉴定法探究

华展义 汤国谦

[摘要]叶螨是一种危害蔬果和植物的重要农业害虫，其个体微小，同种类叶螨形态特征相似度高，外形可变性强，明显的鉴别特征少，给传统的形态学鉴定带来了一定的困难。主要通过雄虫外生殖器阳具端锤的性状对叶螨进行鉴定，但存在一定的局限性，限于某个特定的发育阶段，使得较近的物种区分困难，给叶螨科内个别种类的鉴定和描述带来争议，鉴于此，分子生物学技术被逐渐应用于叶螨的准确鉴定。本研究通过形态学和分子生物学相结合的鉴定手段，探索叶螨的准确鉴定方法。

[关键词]叶螨;形态鉴定;分子鉴定

叶螨种类多、食性杂、危害重，以破坏寄主植物的营养器官叶子为主，取食叶片组织内栅栏层细胞的叶绿体和细胞液，导致叶片受伤脱落，严重时能导致整株植物死亡，一定程度上威胁农作物的质量和产量，给农业生产造成一定经济损失。由于叶螨体型微小，伴随寄主植物或者生长发育的条件改变而存在体色的差异，喜欢躲在植物叶背面取食，且受害植物初期的受害状不明显，导致因忽视没有在初期及时做好防治，虫口增多，对农作物造成严重的危害。

近些年来，农药不合理使用导致农业害螨已经上升为主要害虫，如何有效地对农业害螨进行防治，是推进农业发展需要重点考虑的问题。目前依据形态学的特征对叶螨属物种进行鉴定，在昆虫鉴定中存在主导作用。由于部分叶螨之间形状相似，形态特征鉴定方法容易受到生物性别和发育阶段的限制，单纯依据形态学鉴定很容易造成鉴定错误，要求研究者须有分类学经验才能较好地利用形态之间的差异进行物种鉴定，这些都一定程度上限制了对叶螨的快速、准确鉴定。随着分子生物学技术的发展，分子鉴定技术也得到了发展，成为准确鉴定叶螨的另一种有效技术手段。基于DNA序列的分子生物学鉴定具有不受个体发育阶段的影响和相对稳定的特点，但是叶螨个体较小，不易从单个个体中提取基因组DNA，同时不同地理种群间由于长期的地理隔离和有限的基因漂流也会造成序列之间的变异，导致无法进行PCR扩增或序列比对失败，无法准确地进行叶螨种类的鉴定，存在一定的局限性，因此PCR扩增前处理和扩增引物的选取则尤为关键[l-3]。针对以上单一鉴定手段难以准确对叶螨进行鉴定的现象，本文主要探讨在传统鉴定方法的基础上结合分子生物学鉴定技术，对叶螨物种进行鉴定，旨在探索准确的鉴定方法。

1 形态学技术在叶螨鉴定中的应用

在我国形态学鉴定作为现阶段最传统、最简单可行的方法，在叶螨鉴定中仍然起着重要的主导作用。形态学鉴定中所选取的表型性状主要为多基因决定的数量性状和符合孟德尔遗传规律的单基因性状，如体色、刚毛、触角等显示生物遗传多态性的外观性状。

1.1 形态学在叶螨鉴定中的优点

在檢验检疫工作中，需要准确、快速地鉴定植物检疫中截获的病虫。形态学在叶螨鉴定中的主要优点如下：

（1）鉴定过程简便。鉴定过程中所需的鉴定仪器少，仅需要放大镜和显微镜，操作相对简易，通过放在放大镜下面观察，能直观简便找到主要的形态特征。

（2）鉴定时间短。对于有经验的检验工作者，能在短时间内鉴定具有明显形态鉴别特征的昆虫，得m鉴定结果，这些都大大优于分子鉴定技术。

（3）分类鉴定误差小。在确保昆虫标本完整性的前提下，可多次进行观察试验，方便不同类型的研究者进行重复试验，将试验结果与昆虫模式标本比对，有助于减少鉴定错误。同时，形态学鉴定中间环节少，造成人为误差概率低。

1.2 形态学在叶螨鉴定中的不足

叶螨属种类多、体型微小，同时叶螨种间的性状具有高度近似性，随着调查的深入，形态学鉴定对于有细微差异的种类，往往找不到好的形态鉴别特征，满足不了新发现的复合体及亲缘种的鉴别需要，对形态学鉴定提出了挑战，尤其是对于鉴定经验不够丰富的鉴定者而言，更加困难。由于叶螨在自然条件下具有性比偏雌的特性，雄性叶螨难以采集，为了获得雄性个体，需要消耗一定的时间培养叶螨下一代，耗时较长，下面对形态学分类中的不足进行分析概括：

（1）叶螨性别不同、处于的发育阶段不同等影响了形态学分类。

（2）叶螨遗传可变性高，形态特征易受环境因素影响，形态鉴定存在一定难度。

（3）形态学方法无法准确地对隐种叶螨群体进行鉴定。

（4）进行形态学鉴定，对操作者的经验和专业技术水平要求高，因此，在叶螨形态学发展中需要逐步培养一批专业知识人才。

（5）叶螨个体微小且在制作玻片时容易破裂或在胶液中错位或滚动，导致标本不完整，影响叶螨形态学鉴定。

（6）由于受图像景深及光镜分辨率等因素的影响，高倍显微镜下雄螨阳具端链边缘模糊。

1.3当前叶螨形态学特征鉴定的几种常用方法

1.3.1 经典的形态特征鉴定法

在我国，传统的形态特征鉴定法因外部形态较为直观应用广泛，研究者通过使用显微镜等显微技术对叶螨的假头、躯干、螯肢、须肢、体毛、体表纹理等形态特点进行鉴定，其因要求低、鉴定成本低而被广泛采用，随着显微技术的不断发展，形态学鉴定也能寻找更精细的特征，提高形态学分类的鉴定水平。例如赵岩等[4]利用环境扫描电镜观察人体超微蠕型螨。

1.3.2 数值分类法

数值分类法与分子生物学密切结合，其核心是通过将所有的分类性状加权处理，再以性状间的相似性进行归类，为叶螨不同种群在分子水平上精确鉴定开辟了新的途径。目前有些学者运用数值分类法在叶螨的鉴定上有着一定的成果，侯舒心等[5]选取52种恙螨，每种恙螨相互独立的48个形态测定数据并将定性指标赋值进行系统分析，鉴定结果与传统形态鉴定结果基本一致。

1.3.3应用多媒体专家辅助鉴定系统

近年来信息技术的不断发展有效推动了多媒体鉴定技术在叶螨分类鉴定中的应用，其原理主要是将需要鉴定的生物体视频、图像以及相关特性描述详细输入辅助鉴定系统中，进而对数据进行检索、分析，最后输出鉴定结果。目前计算机专家开发的系统已经在植物检疫中得到了有效应用，不仅对操作人员、实验室设备条件要求较低，也为从事叶螨分类鉴定工作者开拓了新的思路，但就目前情况来看，在叶螨鉴定方面应用较少，需要加强对数据的研究。

鉴于传统形态分类鉴定叶螨容易产生错判等问题，在叶螨鉴定中引入分子生物学技术，从而实现叶螨物种的准确鉴定成为物种鉴定的趋势。

2 分子生物学技术在叶螨鉴定中的应用

2.1 蛋白质标记技术

基于蛋白质多态性发展起来的一种分子标记为蛋白质标记，其原理主要是通过分析某种特定的蛋H质是否存在于群体内或者在个体间的分布的差异性，进而分析总结该群体的遗传情况。目前在叶螨鉴定研究中，蛋白质标记技术应用比较多的为同工酶标记，该技术通过分析同工酶的多态性获得种群的遗传结构和变异情况，相比分子标记技术，同工酶技术具有准确、快速、操作简便、重复性强、共显性表达等优点，在叶螨鉴定中具有不可替代的地位。匡海源等[6]用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定了朱砂叶螨和二斑叶螨群体的几种同工酶，结果显示这两个种的苹果酸酶同工酶及苹果酸脱氨酶MDH2、MDH3同工酶的基因型不同，进而区分朱砂叶螨和二斑叶螨。但同时，同工酶技术也存在一定的缺点：检测位点数少且位点变异分辨力弱，对样品基因组遗传变异的情况不能准确地全面反映;样本质量要求高，不能用于一些需要大量标记的研究中。

2.2 DNA分子标记技术

随着PCR的建立，涌现_『一系列分子生物学技术，DNA分子标记是根据生物个体或种群间基因组DNA多态性而发展起来的能反映DNA水平上差异的特异性DNA片段，可比性好、稳定性高、信息含量高，且不受发育阶段、性别、环境等因素的影响，对澄清某些近缘种和近似种以及种内分类起到了积极作用，但也存在一定的局限性，需要结合形態学鉴定手段。下面就对几种常用的分子标记技术优缺点应用进行分析。

限制性片段长度多态性（RFIP）是一项综合技术，在叶螨种类鉴定和种间种内系统进化关系研究方面有一定的应用，其操作步骤主要包括设计标准序列的扩增引物，然后进行目的基因的提取，提取后使用PCR技术进行扩增，最后限制性内切酶酶切，酶切产物进行凝胶电泳。Osakabe[7]将RFLP技术应用于叶螨科全爪螨属内近似种的区分，能够很好地用于叶螨系统进化关系的研究。但是该技术在鉴定试验过程中需要依赖Southern印迹转移、DNA片段克隆等技术支持，对基因组DNA质量要求高、需要量大等限制。

随机扩增DNA多态性（RAPD）是一种以PCR为基础的DNA分子标记，通过利用随机引物对目的基因进行PCR扩增，扩增产物经电泳后显色，分析扩增产物DNA片段的多态性，从而反映了基因组相应区域的DNA多态性。该技术的优点在于使用的是随机引物，免除了引物设计的烦琐，得到广泛的应用，但RAPD技术不能准确区别杂合子和纯合子，而且由于使用随机引物，故在电泳环节中可能存在共迁移问题[8-ll]。

扩增片段长度多态性（ AFIP）与RFLP的主要区别在于PCR代替Souchen杂交，具有准确、灵敏、快速、稳定性高、重复性好以及所需要的DNA量少等优点，但从技术操作层面来说，AFLP对技术操作要求较高，对基因组DNA和限制性内切酶的质量要求均较高，且技术费用较为昂贵。

2.3 DNA条形码技术

DNA条形码（DNA Barcode）的概念由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出。DNA条形码是生物基因组中普遍存在的、较短的、标准化的DNA序列。因DNA条形码既具有稳定的种内保守性，又包含足够的种间遗传变异，可以用于物种的分子鉴定。Hebert等[12-13]在提出DNA条形码概念之初，即通过线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因（ Cvtochrome Oxidase SubunitI，COI）序列对动物界11门13 320个物种进行分析，结果发现，其中98%的物种可被准确鉴定。I基于COI的叶螨DNA条形码鉴定方面，Hinomoto等[14]通过分析绿色型和红色型二斑叶螨COI基因，证实两者为同一物种，解决了形态学不能解决或者存在疑问的问题。杨顺义等[15]通过COI基因分析，对甘肃不同地区的截形叶螨种群作遗传分化分析，明确了甘肃截形叶螨不同种群间的系统发育及进化关系。除了C01序列外，基于核糖体转录间隔区2（ITS2）序列，Ben等[6]以ITS2基因作为分子标记用于鉴定以色列16个叶螨物种并基于ITS建立系统发育树分析各物种进化关系，从而得出 ITS2在叶螨物种鉴定中的有效性。曹利军等[17]通过核糖体转录间隔区2（ lTS2）序列作为DNA条形码，对我国12个地区的草莓叶螨进行分子鉴定和遗传多样性分析，表明二斑叶螨为这些地区草莓上唯一的叶螨种类，种群内遗传多样性非常低，研究结果对于制定草莓上叶螨的防治策略具有指导意义。不过，DNA条形码分子鉴定也存在一些问题，叶螨个体较小，提取单个个体的基因组相对较为困难，对实验操作有较高的要求，而且操作过程较为烦琐，对实验环境和仪器要求较高[18]。

3 基于形态学与分子生物学技术相结合的叶螨鉴定流程

根据以上对形态学和分子技术的应用阐述，单纯靠传统形态叶螨鉴定方法获得准确的结果较为困难，针对叶螨形态学鉴定困难的现象，如能利用多种分子鉴定手段作为形态鉴定方法的有利补充，能为叶螨属的分类提供准确的鉴定方法，对叶螨属内不同种类的针对性防治具有极其重要的意义[19]。本文将形态学和DNA条形码分子鉴定技术相结合的鉴定流程进行简要介绍。

3.1 形态学特征记录

（1）采集好供试材料，主要采集到6个不同地理区域的叶螨，对采集时间、寄主植物样本信息进行登记。

（2）进行叶螨的形态学鉴定，制定形态完好和清晰透明的叶螨标本。

（3）将制作好的玻片静置合理的时间后放在规定温度的恒温箱中，并在高倍显微镜下观察其用于分类的形态特征。3.2 DNA条形码分子鉴定操作

（1）先将单个螨虫置于1.5ml离心管中，用75%的酒精冲洗消毒，残留酒精挥发后用1.5mL离心管适配的研磨棒进行研磨。

（2）用适当的商品化提取试剂盒，按说明书提取基因组DNA。由于单个螨虫个体小，成螨长约0.5mm，其基因组DNA可用微量组织基因组DNA提取试剂盒进行提取。

（3）用全波长酶标仪检测所提DNA的浓度和纯度，以确定所提取DNA是否满足下一步的PCR扩增要求。

（4）使用COl和lTS2序列引物，配置PCR反应体系，对所提DNA进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳分析扩增是否成功。

（5）将PCR扩增产物双向测序，所得上、下游引物序列用DNAMAN软件进行拼接获得COI或ITS2序列片段。

（6）在NCBI的Blasl中或BOLD的Identification中搜索拼接后获得的序列片段，在搜索结果中对应

同源性最高的物种则为本次分子鉴定的叶螨种类，若同源性高的结果有几个种，还可以通过构建系统发育树进行进一步的序列分析。3.3 分子鉴定与形态学分析相互印证

将分子鉴定的叶螨种类形态学特征与被鉴定叶螨的形态学特征相瓦印证，若描述一致，则可确定叶螨种类。

近年来，由于科学的进步和多学科实验研究方法的借鉴，叶螨的准确鉴定取得了长足进展。鉴于形态学鉴定方法的局限性，本文结合分子技术，结合各自的条件灵活运用，使得鉴定结果更为准确，介绍了形态学和DNA条形码分子鉴定技术相结合的、更为准确的鉴定过程。但是分子生物学技术对实验条件要求较高，操作过程也较为烦琐，一定程度上阻碍了在叶螨分类鉴定中的推广与应用，尤其是在一些条件较差的基层单位，所以如何优化鉴定技术，在保证准确性的前提下，降低实验条件要求，是下一阶段需要研究的课题。

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