江口萝卜猪STAT3基因多态性及生物信息学分析

吴雪 张继 邱淦远 杨茂林 刘若余

摘要：【目的】明确碱基突变对江口萝卜猪STAT3基因mRNA二级结构及其编码蛋白二、三级结构的影响，为更好地开发利用江口萝卜猪种质资源打下基础。【方法】利用江口萝卜猪血样提取基因组DNA构建DNA池，采用混合DNA池结合PCR产物直接测序的方法对STAT3基因进行多态性分析，筛选出SNP多态位点及估算等位基因频率，并进行生物信息学分析。【结果】从江口萝卜猪血样中扩增获得STAT3基因的24个外显子，并筛选出7个SNPs位点，分别是：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A。其中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A为同义突变，不改变其编码氨基酸序列;Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A为错义突变，会导致其编码氨基酸发生改变。Exon22-C43>A突变后致使最小自由能降低为 -755.90 kcal/mol，结构稳定性增强;Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突变均促使最小自由能增加，分别为 -754.00、-753.40和-752.60 kcal/mol，且导致mRNA二级结构改变，结构稳定性降低，其中Exon5-G57>A突变导致mRNA二级结构完全改变。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A突变均可导致编码蛋白二、三级结构的改变，具体表现为α-螺旋增加、β-折叠减少，而无规则卷曲除Exon2-A19>C突变呈增加趋势外，其他突变均呈减少趋势。其中，Exon2-G20>C突变对蛋白二级结构影响最大，而Exon2-A19>C突变的影响最小。【结论】从江口萝卜猪STAT3基因的24个外显子上检测出7个SNPs位点，其中Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4个为错义突变，除了造成编码氨基酸改变外，还导致mRNA及编码蛋白二、三级结构的改变，进而可能对STAT3蛋白的功能造成影响。

关键词： 江口萝卜猪;STAT3基因;SNP位点;错义突变;生物信息学

中图分类号： S828.89                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0461-07

0 引言

【研究意义】江口萝卜猪是贵州省的优良地方猪种之一，主要分布于贵州铜仁市江口县及其毗邻的松桃和碧江等县，具有耐粗饲、适应性强、肉质细嫩等特点，深受当地群众的喜爱（燕志宏等，2010），但江口萝卜猪存在生长缓慢、瘦肉率低等缺陷（毛同辉等，2015）。信号转导及转录激活因子（Signal transducers and activators of transcription，STAT）是胞质中的调控因子，也是一种调控蛋白，具有N端片段保守序列、DNA结合区、SH2结构域、SH3结构域和C端转录激活区等功能区域（Isozaki et al.，2008）。JAK-STAT通路是细胞中的重要信号通路，负责调控多种细胞因子，包括生长激素等相关基因（Richard and Stephens，2011;Clifford and Ward，2013）。因此，深入研究STAT对江口萝卜猪生长发育的调控机制，对利用分子辅助选育改良品种缺陷具有重要意义。【前人研究进展】STAT蛋白主要位于胞质中，当细胞因子与细胞膜上的受体结合，促使与受体偶联的JAK活化，继而结合STAT蛋白使其发生磷酸化修饰，活化STAT蛋白以二聚体的形式进入细胞核与靶基因结合，从而调控基因转录（Khatib et al.，2009;Wang and Huang，2010）。STAT蛋白家族总共有7个成员，分别是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6（Kaplan，2013）。其中，STAT3是一种存在于细胞质中并在酪氨酸磷酸化信号通路中发挥关键作用的功能蛋白，也是一种细胞核转录因子，依赖于细胞因子或生长因子等配体的激活而调控基因表达（Buettner et al.，2002）。STAT3可与STAT1形成异源二聚体或自成同源二聚体进入细胞核与靶基因启动子结合，而调节基因表达（Herrington et al.，2000）。STAT3最早被发现作为IL-6信号传递过程中的中介因子调控免疫反应（Hirano et al.，2000），近年来诸多研究相继报道了STAT3的其他生理功能，如对肝脏快速反应蛋白的调控作用（Subramaniam et al.，2013），敲除STAT3基因导致早期胚胎死亡等（Ohkubo et al.，2013）。STAT3基因在瘦素介导下对生物体的能量平衡也具有一定作用（Wallenius et al.，2002;于月等，2013）。郭弈瑞（2014）研究表明，STAT3基因多态性与肥胖易感性具有一定的相关性;马祖亮（2014）也研究发现，我国汉族人群中STAT3基因多态性具有影响超重、肥胖和脂类代谢紊乱的潜力。此外，STAT3蛋白可作为转录因子参与生长激素等调节过程，从转录水平上调节基因表达，继而调控动物的生长发育。马佩云（2010）以健康的雄性昆明小白鼠骨骼肌细胞为研究对象，分别采用AG490和IL-11进行处理，从细胞水平上证明JAK2-STAT3信号通路会对骨骼肌发育和能量代谢相关基因表达产生影响。【本研究切入点】目前，有关STAT3基因在人类及结合JAK-STAT信号通路的研究较多，但STAT3基因在猪等家畜中的相关研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】构建江口萝卜猪DNA池后直接測序分析，然后运用DNASTAR等在线软件分析筛选出SNP多态位点及估算等位基因频率，并进行生物信息学分析，明确碱基突变对江口萝卜猪STAT3基因mRNA二级结构及其编码蛋白二、三级结构的影响，为更好地开发利用江口萝卜猪种质资源打下基础。

1 材料与方法

1. 1 DNA提取及DNA池构建

56头江口萝卜猪血样均采自贵州江口县，采用Ezup柱式基因组提取试剂盒（血液）提取基因组DNA。基因组DNA以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，DNA浓度使用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计进行测量，每个样本重复3次。将所有样本DNA浓度调整至100 ng/μL，然后各取5.0 μL混合，构建DNA池。

1. 2 引物设计合成及PCR扩增

参考NCBI上已公布的猪STAT3基因序列（GenBank登录号NC_010454.4），运用Primer Premier 5.0设计15对特异性引物，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，各引物序列及其最适退火温度等信息见表1。PCR反应体系20.0 μL：2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，退火30 s、72 ℃ 30 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1. 3 测序分析及等位基因频率估算

选择1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后条带单一且明亮清晰的PCR扩增产物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。测序结果采用DNASTAR中的SeqMan分析测序峰图，并与参考序列进行比对以筛选出SNP位点。同时，采用MWSnap v3.0测量等位基因对应的峰高，根据公式Ai=Bi/（B1+B2）估算等位基因频率。

1. 4 生物信息学分析

采用RNAfold（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）预测单核苷酸突变前、后mRNA二级结构;运用PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）预测突变前、后编码蛋白二级结构，并以SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）预测突变前、后编码蛋白三级结构。

2 结果与分析

2. 1 PCR扩增结果

以基因组DNA为模板，通过PCR分别扩增获得江口萝卜猪STAT3基因的24个外显子（Exon）片段，部分扩增产物的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。清晰观察到图谱中的条带单一、明亮清晰，且无拖带等现象，说明扩增效果好，与预期效果相符。

2. 2 测序分析结果

扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，然后通过DNASTAR和BLAST等在线分析软件与参考序列进行比对分析，发现其高度同源性，并筛选出7个SNPs位点。将各外显子的第1个碱基定义为+1，则这7个SNPs位点分别为：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A。其中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A为同义突变，不会引起编码氨基酸改变，但由于存在简并密码子且使用频率不同，也可能会导致基因的表达差异;Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A为错义突变，可导致其mRNA编码氨基酸改变，具体表现（表2）：Exon2-A19>C突变导致丝氨酸突变为精氨酸（Ser→Arg），Exon2-G20>C突变导致丝氨酸突变为苏氨酸（Ser→Thr），Exon5-C64>A突变导致谷氨酰胺突变为赖氨酸（Gln→Lys），Exon22-C43>A突变导致脯氨酸突变为谷氨酰胺（Pro→Gln）。

2. 3 等位基因频率估算结果

采用MWSnap v3.0测量江口萝卜猪STAT3基因各SNP位点对应的峰高，计算出等位基因频率。由表2可看出，2号外显子（Exon2）上存在3个突变位点，且突变频率均较高，而其他几个外显子上的突变频率较低，说明相对于外显子2，其他外显子可能更加保守。

2. 4 生物信息学分析结果

2. 4. 1 mRNA二级结构预测结果 采用RNAfold预测江口萝卜猪STAT3基因突变前后各基因型mRNA二级结构。Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon22-C43>A突变均未导致mRNA二级结构发生改变，仅Exon22-C43>A突变后致使最小自由能降低为-755.90 kcal/mol，结构稳定性增强，而其他3个突变致使最小自由能分别增加至-754.00、 -754.60和-750.10 kcal/mol，导致结构稳定性降低。Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突变均促使最小自由能增加，分别为-754.00、-753.40和-752.60 kcal/mol，且导致mRNA二级结构改变，结构稳定性降低，其中，Exon5-G57>A突变导致mRNA二级结构完全改变，可能对蛋白翻译有明显影响。

2. 4. 2 编码蛋白二级结构预测结果 采用PredictProtein对江口萝卜猪STAT3基因不同基因型编码蛋白二级结构进行预测，结果（表3）表明，Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A突变均会导致编码蛋白二级结构的改變，具体表现为α-螺旋增加、β-折叠减少，而无规则卷曲除Exon2-A19>C突变呈增加趋势外，其他突变均呈减少趋势。其中，Exon2-G20>C突变对编码蛋白二级结构影响最大，而Exon2-A19>C突变的影响最小。

2. 4. 3 编码蛋白三级结构预测结果 利用SWISS-MODEL对江口萝卜猪STAT3基因不同基因型编码蛋白三级结构进行预测。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A、E-xon22-C43>A突变均会导致编码蛋白三级结构发生改变。

3 讨论

STAT蛋白家族是JAK-STAT信号通路中的重要调控因子，调控着多种细胞因子信号通路（Kaplan，2013）。STAT3是其中的重要一员，对生物的生长发育起重要调控作用。许多细胞因子受体，如表皮生长因子受体（EGFGR）、血管内皮生长因子受体（VEFGR）等均可促进STAT3活化，而参与生长调节过程（Chung et al.，2017）。当IL6和IL10等细胞因子与靶细胞表面受体结合后，此时受体还能结合同源或异源的寡聚蛋白，同时激活与其偶联的JAKs;随后激活的JAKs可促使STAT3蛋白C端的酪氨酸残基磷酸化，进而形成同源二聚体或与STAT1形成异源二聚体进入细胞核，与其他转录因子相互作用共同调节基因转录表达（宋舟等，2012）。STAT3在早期胚胎脑发育阶段高度表达，但后期表达呈下调趋势。早期STAT3基因高度表达有利于内源性神经干细胞的增殖和稳定，后期表达下调则可促进相邻细胞的神经元分化（Zhao et al.，2016）。此外，受外部刺激时，STAT3信号通路被激活并激发其C端酪氨酸705区磷酸化，提高运动神经元六聚物在STAT3信号通路上游信号的转录活动，而增强运动神经元六聚物的表达（Lee et al.，2013），说明STAT3基因对运动神经元的发育也有调控作用。杨永强等（2013）以务川黑牛和贵州荷斯坦奶牛构建DNA池并扩增STAT3基因启动子，筛选出7个SNPs位点，发现Promoter322-A>G可能是影响肉牛生长性状的重要功能性SNP位点;Tripathi等（2017）发现STAT3是调控人类Th17细胞早期分化的关键因子。可见，STAT3基因的研究不仅在疾病治疗及预防上具有很高价值，还有助于揭示其对动物生长发育的作用机制。

本研究利用江口萝卜猪血样提取基因组DNA构建DNA池，首次从江口萝卜猪血样中扩增获得STAT3基因的全部外显子，并筛选出7个SNPs位点：Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon2-G74>A、Exon4- T81>A、Exon5-G57>A、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A，分别位于第2、4、5和22号外显子上，其余外显子均未检测到SNP位点。说明其他外显子相较于这4个外显子可能更加保守，突变频率更低，也可能由于样本容量较小所致，具体原因有待进一步研究证实。在这7个SNPs位点中，Exon2-G74>A、Exon4-T81>A和Exon5-G57>A为同义突变，Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A为错义突变。本研究还发现，外显子2上3个突变位点的突变频率均最高，说明其他外显子相对更加保守。此外，通过预测碱基突变前后的mRNA二级结构，发现只有Exon22-C43>A突变后致使最小自由能减小为-755.90 kcal/mol，结构稳定性增强，其他突变则导致最小自由能增加，稳定性减弱，尤其是Exon2-A19>C、Exon5-G57>A和Exon5-C64>A突變导致mRNA二级结构改变，且有可能对STAT3蛋白的翻译造成影响。Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4个错义突变还会导致编码蛋白二级结构发生改变，如α-螺旋增加、β-折叠减少等，对编码蛋白三级结构也有一定影响，但这些变化对STAT3蛋白的功能是否产生影响还有待进一步探究。

本研究从江口萝卜猪STAT3基因的24个外显子上检测出7个SNPs位点，且均无文献记载;通过预测碱基突变前后的mRNA及翻译蛋白结构，发现其中4个错义突变有可能改变STAT3基因表达，而对江口萝卜猪的生长发育造成影响。该结论有助于深入研究STAT3基因在猪生产性能开发上的作用，为江口萝卜猪的分子育种打下基础。

4 结论

从江口萝卜猪STAT3基因的24个外显子上检测出7个SNPs位点，其中Exon2-A19>C、Exon2-G20>C、Exon5-C64>A和Exon22-C43>A 4个为错义突变，除了造成编码氨基酸改变外，还导致mRNA及编码蛋白二、三级结构的改变，进而可能对STAT3蛋白的功能造成影响。

参考文献：

郭奕瑞. 2014. STAT3基因多态性与河南汉族人群肥胖易感性的关系[D]. 郑州：郑州大学. [Guo Y R. 2014. Association of polymorphism of STAT3 gene with the susceptibility of obesity in Henan Han population[D]. Zhengzhou：Zhengzhou University.]

马佩云. 2010. JAK2/STAT3通路对小鼠骨骼肌发育、能量代谢及肌间脂肪相关基因表达的影响[D]. 杨凌：西北农林科技大学. [Ma P Y. 2010. The effect of JAK/STAT3 signal pathway on the expression of skeletal muscle deve-lopment and energy metabolic related genes in mice[D]. Yangling：Northwest A & F University.]

馬祖亮. 2014. 中国汉族人群STAT3基因多态性与肥胖及脂类代谢紊乱的关联研究[D]. 广州：南方医科大学. [Ma Z L. 2014. Association of polymorphisms of STAT3 with obesity and lipid metabolic disorders in Chinese Han population[D]. Guangzhou：Southern Medical University.]

毛同辉，吴高奇，郭义军. 2015. 江口萝卜猪种质资源研究进展与开发利用[J]. 中国猪业，（6）：74-76. [Mao T H，Wu G Q，Guo Y J. 2015. Research progress and exploitation of Jiangkouluobo pig germplasm resources[J]. China Swine Industry，（6）：74-76.]

宋舟，张立艳，董海兵，白换力，陈伟，吴帅成，伊鹏霏，付本懂，申海清，韦旭斌. 2012. JAK-STAT信号通路研究进展[J]. 中国畜牧兽医，39（6）：128-132. [Song Z，Zhang L Y，Dong H B，Bai H L，Chen W，Wu S C，Yi P F，Fu B D，Shen H Q，Wei X B. 2012. Advances in JAK-STAT signaling pathway[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，39（6）：128-132.]

燕志宏，吴高奇，毛同辉，冯文豪，雷荷仙，龙真权，孟华，张廷刚，樊荣. 2010. 江口萝卜猪种质特性的研究[J]. 贵州农业科学，38（12）：176-178. [Yan Z H，Wu G Q，Mao T H，Feng W H，Lei H X，Long Z Q，Meng H，Zhang T G，Fan R. 2010. Study on germplasm characteristics of Jiangkouluobo pig[J]. Guizhou Agricultural Sciences，38（12）：176-178.]

杨永强，焦仁刚，龚俞，谢海强，惠嫣婷，张依裕，肖超能，刘若余. 2013. 务川黑牛STAT3基因启动子区SNPs与生长相关性状的关联分析[J]. 畜牧兽医学报，44（8）：1205-1212. [Yang Y Q，Jiao R G，Gong Y，Xie H Q，Hui Y T，Zhang Y Y，Xiao C N，Liu R Y. 2013. Associations of polymorphisms of promoter region of STAT3 gene with growth traits in Wuchuan black cattle[J]. Acta Veterinaria et Zoothenica Sinica，44（8）：1205-1212.]

于月，尤佳， 杨柳，刘勇. 2013. 瘦素信号转导通路在能量代谢平衡中的作用机制[J]. 生命科学，25（2）：169-175. [Yu Y，You J，Yang L，Liu Y. 2013. Leptin receptor signaling in energy homeostasis[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences，25（2）：169-175.]

Buettner R，Mora L B，Jove R. 2002. Activated STAT signa-ling in human tumors provides novel molecular targets for therapeutic intervention[J]. Clinical Cancer Research，8（4）：945-954.

Chung S S，Wu Y，Okobi Q，Adekoya D，Atefi M，Clarke O，Dutta P，Vadgama J V. 2017. Proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α increased telomerase activity through NF-κB/STAT1/STAT3 activation，and withaferin a inhibi-ted the signaling in colorectal cancer cells[J]. Mediators of Inflammation，2017：5958429. doi：10.1155/2017/5958429.

Clifford L，Ward A C. 2013. Evolution of the JAK-STAT pathway[J]. JAK-STAT，2（1）：e22756.

Herrington J，Smit L S，Schwartz J，Carter-Su C. 2000. The role of STAT proteins in growth hormone signaling[J]. Oncogene，19（21）：2585-2597.

Hirano T，Ishihara K，Hibi M. 2000. Roles of STAT3 in media-ting the cell growth，differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors[J]. Oncogene，19（21）：2548-2556.

Isozaki T，Kasama T，Takahashi R，Odai T，Wakabayashi K，Kanemitsu H，Nohtomi K，Takeuchi H T，Matsukura S，Tezuka M. 2008. Synergistic induction of CX3CL1 by TNF alpha and IFN gamma in osteoblasts from rheumatoid arthritis：Involvement of NF-kappa B and STAT-1 signaling pathways[J]. Journal of Inflammation Research，1：19-28.

Kaplan M H. 2013. STAT signaling in inflammation[J]. JAK-STAT，2（1）：e24198.

Khatib H，Huang W，Mikheil D，Schutzkus V，Monson R L. 2009. Effects of signal transducer and activator of transcription（STAT） genes STAT1 and STAT3 genotypic combinations on fertilization and embryonic survival rates in Holstein cattle[J]. Journal of Dairy Science，92（12）：6186-6191.

Lee S，Shen R，Cho H H，Kwon R J，Seo S Y，Lee J W，Lee S K. 2013. STAT3 promotes motor neuron differentiation by collaborating with motor neuron-specific LIM complex[J]. Proceedings of the National Academy of Scien-ces of the United States of America，110（28）：1144511450.

Ohkubo N，Suzuki Y，Aoto M，Yamanouchi J，Hirakawa S，Yasukawa M，Mitsuda N. 2013. Accelerated destruction of erythrocytes in Tie2 promoter-driven STAT3 conditional knockout mice[J]. Life Sciences，93（9-11）：380-387.

Richard A J，Stephens J M. 2011. Emerging roles of JAK-STAT signaling pathways in adipocytes[J]. Trends in Endocrinology and Metabolism，22（8）：325-332.

Subramaniam A，Shanmugam M K，Perumal E，Li F，Nachiyappan A，Dai X，Swamy S N，Ahn K S，Kumar A P，Tan B K，Hui K M，Sethi G. 2013. Potential role of signal transducer and activator of transcription（STAT）3 signa-ling pathway in inflammation， survival，proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1835（1）：46-60.

Tripathi S K，Chen Z，Larjo A，Kanduri K，Nousiainen K，Äijo T，Ricaño-Ponce I，Hrdlickova B，Tuomela S，Laajala E，Salo V，Kumar V，Wijmenga C，Lähdesmäki H，Lahesmaa R. 2017. Genome-wide analysis of STAT3-mediated transcription during early human Th17 Cell differentiation[J]. Cell Reports，19（9）：1888-1901.

Wallenius V，Wallenius K，Ahrén B，Rudling M，Carlsten H，Dickson S L，Ohlsson C，Jansson J O. 2002. Interleukin-6-deficient mice develop mature-onset obesity[J]. Nature Medicine，8（1）：75-79.

Wang Y H，Huang M L. 2010. Organogenesis and tumori-genesis：Insight from the JAK/STAT pathway in the Drosophila eye[J]. Developmental Dynamics，239（10）：2522-2533.

Zhao L，Du X，Huang K，Zhang T，Teng Z，Niu W，Wang C，Xia G. 2016. Rac1 modulates the formation of primordial follicles by facilitating STAT3-directed Jagged1，GDF9 and BMP15 transcription in mice[J]. Scientific Reports，6：23972. doi：10.1038/srep23972.

（責任编辑 兰宗宝）