颈腰康胶囊的抗炎消肿药效物质基础研究

2019-09-10徐杰姜文月王雅俪王美慧魏晓雨边雨

中国药房 2019年4期

徐杰姜文月王雅俪王美慧魏晓雨边雨

中图分类号 R965.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）04-0478-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.10

摘要目的：研究颈腰康胶囊抗炎消肿药效的物质基础，为该制剂的二次开发、质量控制方法建立和技术改造升级提供依据。方法：采用不同溶剂以及大孔吸附树脂法对颈腰康胶囊进行组分提取分离，获得A组分（总体富集部位）、B组分（氯仿萃取部位）、C组分（水层部位）和D组分（60%乙醇洗脱部位）。通过小鼠耳廓肿胀实验和大鼠足跖肿胀实验，以醋酸地塞米松为阳性对照药物，考察颈腰康胶囊及其不同提取部位（A、B、C、D组分）的抗炎消肿作用，筛选功效部位。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q-TOF-MS）解析功效部位，鉴定其中所含化合物并进行组方药材归属。结果：B组分（氯仿萃取部位）+D组分（60%乙醇洗脱部位）对大鼠或小鼠的抗炎消肿疗效与颈腰康胶囊相当，提示二者发挥了协同抗炎消肿作用，是颈腰康胶囊的功效部位。UPLC-Q-TOF-MS检测及鉴定结果显示，B组分中含有士的宁、黄柏碱、杠柳苷元、石松四酮醇、11-羰基-β-乳香酸等13个化合物，分别归属于马钱子、防己、香加皮、伸筋草、乳香等药材；D组分中含有腺嘌呤、羟基红花黄色素A、黄柏碱、Neoeriocitrin、姜狀三七皂苷R1等7个化合物，分别归属于地龙、红花、防己、骨碎补、牛膝等药材。结论：颈腰康胶囊具有显著的抗炎消肿作用，其氯仿萃取部位与60%乙醇洗脱部位可能共同为其抗炎消肿的功效部位，所含主要成分为生物碱类、黄酮类及乳香酸类化合物。

关键词颈腰康胶囊；提取；分离；抗炎；消肿；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术；活性成分；物质基础

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory and detumescent pharmacodynamic material basis of Jingyaokang capsule， and to provide reference for secondary development， the establishment of quality control method and technological upgrading of the preparations. METHODS： The constituents of Jingyaokang capsule were extracted and separated with different solvents and macroporous adsorption resin to obtain constituent A （overall enrichment part）， constituent B （chloroform extraction part）， constituent C （water-course part） and constituent D （elution part of 60% ethanol）. Using dexamethasone acetate as positive control， the anti-inflammatory and detumescent effects of Jingyaokang capsule and different extraction parts （constituents A， B， C， D） were investigated by mice ear edema and rat paw edema tests to screen the active fraction. UPLC-Q-TOF-MS method was used to analyze active constituent， identify compounds and attribute medicinal material. RESULTS： Anti-inflammatory and detumescent effects of constituent B （chloroform extraction part）+constituent D （elution part of 60% ethanol） were similar to those of Jingyaokang capsule in rats or mice， indicating both had synergistic anti-inflammatory and detumescent effects and were active constituents of Jingyaokang capsule. UPLC-Q-TOF-MS detection and identification showed that constituent B contained 13 compounds as strychnine， phellodendrine， periplogenin， tetraketone alcohol， 11-carbonyl-β-mastic acid， attributing to Strychnos nux-vomica， Stephania tetrandra， Periploca sepium， Lycopodium japonicum， Boswellia carterii， etc. Constituent D contained 7 compounds as adenine， hydroxysafflower yellow A， phellodendrine， neoeriocitrin， zingibroside R1， attributing to rainworm， Carthamus tinctorius， Stephania tetrandra， Davallia mariesii， Achyranthes bidentata， etc. CONCLUSIONS： Jingyaokang capsule shows the significant anti-inflammation and detumescent effects. The chloroform extraction part is synergistic with 60% ethanol elution part， which are the active constituents of anti-inflammation and detumescence，mainly including alkaloids， flavonoids and boswellic acids.

KEYWORDS Jingyaokang capsule； Extraction； Separation； Anti-inflammation； Detumescence； UPLC-Q-TOF-MS； Active constituent； Material basis

頸腰康胶囊是由制马钱子、伸筋草、香加皮、乳香、没药、红花、地龙、烫骨碎补、防己、牛膝等10味药材组方的中成药制剂，具有舒筋通络、活血化瘀、消肿止痛的功效，主要用于骨折后瘀血及肿胀疼痛、骨折恢复期以及肾虚挟瘀所致痹痛（如增生性脊柱炎、腰椎间盘脱出症）等的治疗[1]。然而截至目前，尚未见有关于颈腰康胶囊抗炎消肿功效的具体活性成分的研究报道。本研究根据制剂中各组方药材中不同成分的理化性质，通过石油醚提取、水提醇沉、95%乙醇提取、氯仿萃取和大孔吸附树脂分离等方法获得各药物组分；同时结合药理学方法，通过小鼠耳廓肿胀与大鼠足跖肿胀等模型，考察不同提取部位的功效作用，筛选该制剂的抗炎消肿功效部位；然后运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q-TOF-MS）解析所筛选的功效部位，根据相对分子量及串联质谱信息对各组分进行结构鉴定，明确功效活性成分，揭示颈腰康胶囊抗炎消肿药效的物质基础，为该制剂的二次开发、质量控制方法建立和技术改造升级提供依据。

1 材料

1.1 仪器

JY2003型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；Acquity UPLC型液相色谱仪、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS型质谱仪（包含四级杆飞行时间串联质量分析器、MassLynx V4.1工作站等组件，美国Waters公司）；SB-1200D型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

颈腰康胶囊（修正药业集团股份有限公司，批号：160913，规格：0.33 g/粒）；醋酸地塞米松片（天津天药药业股份有限公司，批号：160313，规格：0.75 mg）；氯化钠注射液（作为生理盐水使用，吉林省都邦药业股份有限公司，批号：1509290509，规格：500 mL ∶ 4.5 g）；二甲苯（北京化工厂，批号：20161020）；角叉菜胶（美国Sigma-Aldrich公司，批号：1408463）；D101大孔吸附树脂（天津市大钧科技开发有限公司）；乙腈为色谱纯，石油醚（30～60 ℃）、氯仿等试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为去离子水。

1.3 动物

ICR小鼠108只，雄性，体质量为18～22 g，生产许可证：SCXK（吉）-2011-0004；Wistar大鼠108只，雌雄各半，体质量为180～220 g，生产许可证号：SCXK（吉）2016-0003。实验动物均由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，在温度20.0～25.9 ℃、湿度40.0%～70.0%、换气次数≥15次/h、12 h明暗交替的条件下饲养。

2 方法与结果

2.1 颈腰康胶囊组分的分离制备

取该制剂内容物500 g，加石油醚700 mL，超声（功率：300 W，频率：50 kHz）脱脂20 min×3次，滤过，药渣干燥。在石油醚脱脂药渣中再加12倍量水（V/m，mL/g，以下同），加热回流3 h，滤过；再加8倍量水，加热回流3 h，滤过。合并2次提取上清液，70 ℃减压浓缩至1 g（生药）/mL；加适量95%乙醇使乙醇最终体积分数为80%，4 ℃静置过夜醇沉；3 000 r/min离心5 min，收集上清液，4 ℃贮存待用。取水提药渣，加6倍量95%乙醇，80 ℃加热回流2次，每次1 h；合并2次提取液，并与上述水提醇沉上清液合并，50 ℃减压浓缩至1 g（生药）/mL；70 ℃减压干燥，得到A组分。

取A组分样品溶于适量水中，加盐酸调节pH至1～2，混匀待充分溶解后，加5 mol/L NaOH溶液调节pH至11～12；以氯仿400 mL萃取3次，静置分离。取氯仿层挥干溶剂，70 ℃减压干燥，得B组分（氯仿萃取部位）。另取水层，70 ℃减压干燥，得C组分（水层部位）。

取C组分样品溶于适量水中，上样至D101大孔吸附树脂，依次用3倍柱体积的水、60%乙醇依次洗脱；收集60%乙醇洗脱液，50 ℃减压浓缩至2 g（生药）/mL；70 ℃减压干燥，得D组分（60%乙醇洗脱部位）。

颈腰康胶囊各部位组分提取分离路线见图1；各部位组分制备得率见表1。

2.2 颈腰康胶囊的抗炎消肿药效学实验

2.2.1 给药剂量确定设定小鼠灌胃给药体积为10 mL/kg，醋酸地塞米松片、颈腰康胶囊按临床用药剂量折算小鼠给药剂量[2]，分别为150、450 mg/kg（以5%羧甲基纤维素钠生理盐水溶液溶解后给药）；按表1中颈腰康胶囊各提取分离部位（A、B、C、D）制备得率折合计算其给药剂量，分别为80、15、63、13 mg/kg（溶剂同前）。空白对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。

设定大鼠灌胃给药体积为10 mL/kg，醋酸地塞米松片、颈腰康胶囊按临床用药剂量折算大鼠给药剂量[2]，分别为100、313 mg/kg（溶剂同前）；按表1中颈腰康胶囊各提取分离部位（A、B、C、D）制备得率折合计算其给药剂量，分别为54、10、44、9 mg/kg（溶剂同前）。空白对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水。

2.2.2 小鼠耳廓肿胀实验参照文献[3-4]方法进行实验。取雄性小鼠108只，随机分为空白对照组、模型组、地塞米松组（阳性对照）、颈腰康胶囊组、A组分组、B组分组、C组分组、D组分组、B+D组分组，每组12只，分别按“2.2.1”项下给药剂量连续给药5 d。于给药第3天时，取二甲苯按20 μL/只涂抹于小鼠右耳内外两侧；于末次给药1 h后，用乙醚麻醉小鼠，再取二甲苯按20 μL/只涂抹于小鼠右耳内外两侧。空白对照组小鼠双耳及其余组小鼠左耳始终不作任何处理。30 min后，处死小鼠，剪下其双耳，用打孔器在相同部位打下圆形耳片并称定质量，计算小鼠耳廓肿胀度、肿胀率及肿胀抑制率。耳廓肿胀度（mg）=右耳片质量-左耳片质量；肿胀率（%）=（右耳片质量-左耳片质量）/左耳片质量×100%；肿胀抑制率（%）=（模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/模型组平均肿胀度×100%。各组小鼠耳廓肿胀实验结果见表2。

如表2所示，与空白对照组比较，模型组小鼠耳廓肿胀度显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），表明模型复制成功。与模型组比较，颈腰康胶囊组小鼠耳廓肿胀度显著降低（P<0.01），表明颈腰康膠囊具有显著的抗炎消肿效果。与颈腰康胶囊组比较，A组分组小鼠耳廓肿胀度差异无统计学意义（P>0.05），提示A组分为颈腰康胶囊药效成分的总体富集部位；而基于A组分分离制备的B、C、D 3个组分组小鼠的耳廓肿胀度与模型组比较虽显著降低，但与颈腰康胶囊组比较仍显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01），表明B、C、D 3个组分均未富集到颈腰康胶囊的药效成分，提示其药效组分间可能存在协同作用。与颈腰康胶囊组比较，B+D组分组小鼠耳廓肿胀度差异无统计学意义（P>0.05），表明B组分与D组分联合药效与颈腰康胶囊相当，提示二者具有协同抗炎消肿作用，可能共同作为颈腰康胶囊的抗炎消肿药效活性物质。

2.2.3 大鼠足跖肿胀实验参照文献[5-7]方法进行实验。取大鼠108只，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、地塞米松组（阳性对照）、颈腰康胶囊组、A组分组、B组分组、C组分组、D组分组、B+D组分组，分别按“2.2.1”项下给药剂量连续给药5 d。于末次给药1 h后，除空白对照组大鼠注射等量生理盐水外，其余大鼠在右后足注射1%角叉菜胶溶液0.1 mL进行致炎。测定致炎前和致炎后1、2、3、4 h时大鼠右后足跖容积，计算足跖肿胀度。肿胀度（mL）=致炎后足跖容积-致炎前足跖容积。各组大鼠足跖肿胀实验结果见表3。

如表3所示，与空白对照组比较，模型组大鼠足跖肿胀度显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），表明模型复制成功。与模型组比较，颈腰康胶囊组大鼠足跖肿胀度显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），表明颈腰康胶囊具有显著的抗炎消肿功效。与颈腰康胶囊组比较，各组分组大鼠足跖肿胀度差异结果与“2.2.2”项下小鼠耳廓肿胀实验结果一致，进一步证明B组分与D组分联合药效与颈腰康胶囊相当，二者具有协同抗炎消肿作用，可能共同作为颈腰康胶囊的抗炎消肿药效活性物质。

2.3 药效组分质谱解析

按“2.2”项下药效学实验结果，对颈腰康胶囊的功效部位B、D组分进行质谱解析。

2.3.2 质谱条件电喷雾离子源（ESI）；定量分析质量扫描范围：m/z 50～1 600 Da；电离源温度：110 ℃；去溶剂气温度：300 ℃；锥孔气、去溶剂气均为氮气；流速分别为50、600 L/h；负离子模式：毛细管电压2.0 kV，提取锥孔电压5.0 V，锥孔电压35 V；正离子模式：毛细管电压3.5 kV，提取锥孔电压5.0 V，锥孔电压35 V；全信息串联质谱（MSE）模式进行二级分析，碰撞气为氩气，低碰撞能10 eV，高碰撞能30～50 eV。采用甲酸钠建立质量标准曲线，以亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正。

2.3.3 B组分质谱解析 B组分质谱分析总离子流图见图2。经过一级质谱、二级质谱分析并参考文献[8]，对各个峰进行解析与鉴定，共鉴别13个化合物：1号峰为士的宁，2号峰为马钱子碱，3号峰为伪马钱子碱，4号峰为番木鳖次碱，归属于制马钱子药材；5号峰为黄柏碱，6号峰为防己诺林碱，7号峰为粉防己碱，归属于防己药材；8号峰为杠柳苷元，归属于香加皮药材；9号峰为石松四酮醇，归属于伸筋草药材；10号峰为11-羰基-β-乳香酸，11号峰为11-羰基-β-乙酰乳香酸，12号峰为榄香酮酸，13号峰为乙酰基-α-乳香酸，归属于乳香药材。各化学成分分析鉴定结果见表4。

2.3.4 D组分质谱解析 D组分质谱分析总离子流图见图3。经过一级质谱、二级质谱分析并参考文献[8]，对各个峰进行解析与鉴定，共鉴别7个化合物：1号峰为腺嘌呤，归属于地龙药材；2号峰为羟基红花黄色素A，3号峰为苯甲酸，归属于红花药材；5号峰为黄柏碱，归属于防己药材；6号峰为Neoeriocitrin，7号峰为柚皮苷，归属于骨碎补药材；9号峰为姜状三七皂苷R1，归属于牛膝药材。各化学成分分析鉴定结果见表5。

3 讨论

本研究采用水和95%乙醇联合提取，收集颈腰康胶囊中的主要成分；采用石油醚超声前处理及水提液醇沉，去除树脂类、多糖类、蛋白质类成分[9-11]；水提醇沉上清液与95%乙醇提取液合并得A组分；A组分浓缩后以酸水溶解，以碱性氯仿萃取富集得生物碱类B组分，并分离出水层非生物碱类C组分[12-15]；采用D101大孔吸附树脂对水层组分进一步分离，以60%乙醇洗脱富集得黄酮类等D组分[16-18]。

本研究以药效学指标进行筛选，证实提取分离得到氯仿萃取部位（B组分）与60%乙醇洗脱部位（D组分）可能共同为颈腰康胶囊抗炎消肿的活性组分。同时，将药效学结果与化学成分的质谱鉴定相结合，运用UPLC-Q-TOF-MS技术进行成分鉴定。氯仿萃取部位共鉴别13个化合物，其中4个化合物归属于制马钱子药材，依次为士的宁、马钱子碱、伪马钱子碱、番木鳖次碱；3个化合物归属于防己药材，依次为黄柏碱、防己诺林碱、粉防己碱；1个化合物归属于香加皮药材，为杠柳苷元；1个化合物归属于伸筋草药材，为石松四酮醇；4个化合物归属于乳香药材，依次为11-羰基-β-乳香酸、11-羰基-β-乙酰乳香酸、榄香酮酸、乙酰基-α-乳香酸。60%乙醇洗脱部位共鉴别7个化合物，其中1个化合物归属于地龙药材，为腺嘌呤；2个化合物归属于红花药材，依次为羟基红花黄色素A、苯甲酸；1个化合物归属于防己药材，为黄柏碱；2个化合物归属于骨碎补药材，依次为Neoeriocitrin、柚皮苷；1个化合物归属于牛膝药材，为姜状三七皂苷R1。这一结果与本课题组前期研究发现的颈腰康胶囊镇痛药效物质基础研究[8]结果一致。

颈腰康胶囊为临床有效的经典方剂，但其抗炎消肿药效物质基础尚未完全明确。本研究初步揭示了该复方制剂中抗炎消肿的主要有效成分，并确定了其中的抗炎消肿药效物质基础，可为后续针对其药效物质成分建立特征指纹图谱提供依据，进而有助于提高颈腰康胶囊的产品质量，实现该制剂的技术改造升级。

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