光强对坛紫菜自由丝状体营养藻丝生长及生理指标的影响

翁祖桐

摘 要：【目的】探讨坛紫菜自由丝状体营养藻丝快速生长的最适宜光照强度。【方法】以坛紫菜新品种申福2号自由丝状体营养藻丝为培养材料，研究不同光照强度（10、20、40、80、100 μmol·photons m-2·s-1）对自由丝状体营养藻丝生长、光系统PSⅡ最大量子效率、光合色素含量、光合作用及抗氧化酶活性的影响。【结果】经25 d培养后，坛紫菜自由丝状体营养藻丝的增重随光照强度梯度增加而表现出先增加后降低的趋势，其中80 μmol·photons m-2·s-1光照强度培养下的藻体增重最多，且光系统PSⅡ最大量子效率Fv/Fm值最高。叶绿素a、类胡萝卜素、藻红蛋白含量整体上随光强的增加而逐渐降低，藻蓝蛋白含量则在各组间差异不显著。藻体CA和RubisCO酶活性均随光强增加而呈现先增强后减弱的趋势。其中，以40 μmol·photons m-2·s-1培养下的酶活性最强，80 μmol·photons m-2·s-1次之。超氧阴离子自由基和SOD在不同光强下的活性随光强增加呈现先减弱后增强的趋势，80 μmol·photons m-2·s-1下培养的坛紫菜自由丝状体营养藻丝这两种酶的活性均最低，分别为最高活性试验组的24.0%和22.9%。【结论】在80 μmol·photons m-2·s-1培养下，坛紫菜自由丝状体营养藻丝增重最多，藻体最大量子效率Fv/Fm值最大，RubisCO和CA活性较强，超氧阴离子和SOD活性最低，该光照强度最有利于坛紫菜自由丝状体营养藻丝的快速增殖。

關键词：坛紫菜;自由丝状体;光照强度;生长;生理指标

中图分类号：S 968.43文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）04-488-07

Abstract：【Objective】Intensity of LED light for optimal growth of free-living conchocelis of Pyropia haitanensis （FCP） was studied.【Method】The effects of varied light intensities （i.e.， 10， 20， 40， 80 or 100 μmol ·photons m-2·s-1） using LED on the growth， maximal quantum efficiency （Fv/Fm） on PS II， content of photosynthetic pigments as well as the photosynthesis and antioxidant enzymes of Shenfu No.2， a new cultivar of P. haitanensis， were determined.【Result】After 25 d of culturing， the weight of algae increased with increasing intensity of illumination and peaked when 80 μmol·photons m-2·s-1 was applied. As the weight reached the maximum， the Fv/Fm on PS II was also at its highest level. On the other hand， the contents of chlorophyll a， carotenoids， and phycoerythrin decreased gradually as the light intensity increased. No significant differences on phycocyanin among the groups were observed. The greatest activities of CA and RubisCO in the algae were observed under 40 μmol·photons m-2·s-1 followed by 80 μmol·photons m-2·s-1 treatment before a decline. Upon an increase on light intensity， the activities of superoxide anion radicals and SOD decreased to the lowest level under 80 μmol·photons m-2·s-1 and then raised again. 【Conclusion】 The vegetative filaments of FCP cultured under 80 μmol·photons m-2·s-1 light appeared to render the highest algae growth rate and Fv/Fm， lowest activities of superoxide anions and SOD， and strongest activities of RubisCO and CA.

Key words： Pyropia haitanensis; free-living conchocelis; light intensity; growth; physiological characteristics

0 引言

【研究意义】坛紫菜Pyropia haitanensis在系统分类上属于红藻门，原红藻纲Protoflorideae，红毛菜目Bangiales，红毛菜科Bangiaceae，Pyropia属[1]，广泛栽培于我国福建、浙江、广东等沿海地区，其年产量占全国紫菜年总产量的3/4以上。随着坛紫菜优良品种培育工作的不断深入，许多新品种（系）都开始采用自由丝状体采苗的育苗工艺[2-4]。以坛紫菜自由丝状体为种源，可保持新品种（系）的遗传稳定，防止因其他外源种质混入而引起的种质退化。因此，通过培养条件的优化，短时间内培养出丰富优质的坛紫菜良种的自由丝状体，对实现坛紫菜的良种化生产至关重要。【前人研究进展】目前有关坛紫菜自由丝状体生长发育的生态因子研究，主要集中在光照[5-7]、温度[5]、盐度和营养盐供给水平[6]等方面。光是光合生物进行光合作用的能量来源，是大多数生物赖以生存的物质基础。光照强度是光的一个重要属性，不同光照强度会对植物体生长、发育产生不同程度的影响[8-9]。相关研究表明，在弱光下，许多藻类会增加藻胆蛋白及光合色素含量，有效收集光合作用所需的光能，而当光照强度加强时，捕光色素比例降低，减少光吸收，进而保护细胞[10]。不同光照强度还会影响藻类光合过程的关键限速酶活性[11]，并改变光系统活性[12-13]。【本研究切入点】紫菜叶状体通常具有较高的光饱和点[14]，丝状体较叶状体却对光强更为敏感，相关的坛紫菜自由丝状体培养大多数处在较低的光照强度（20、27、40 μmol·photons m-2·s-1）下[5-6]，而在高光强下（156 μmol·photons m-2·s-1）丝状体光系统PSⅡ的电子传递速率会明显下降[15]。因此，在此基础上，筛选出最适宜光强进行坛紫菜自由丝状体营养藻丝的快速增殖，不仅可以充分发挥营养藻丝的光适应能力，还能够提高其光能利用效率和生长速率，具有重要的实际生产意义。但有关丝状藻丝营养增殖与光因子的关系却鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究以光照强度作为单一变量，研究了不同梯度的光照强度（10、20、40、80、100 μmol·photons m-2·s-1）的LED光源对坛紫菜新品种申福2号自由丝状体营养藻丝的特定生长率、PSⅡ最大光量子效率、主要光合色素含量及部分抗氧化酶活性等生理指标的影响，旨在筛选出最适宜的光照强度用于坛紫菜良种自由丝状体营养藻丝的快速扩繁。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以坛紫菜新品种申福2号自由丝状体营养藻丝作为试验材料[4]，材料保存于福建省大成水产良种繁育试验中心的保种室内，保存方法参照Kato等[16]的方法。

1.2 试验方法

1.2.1 自由丝状体营养藻丝的同步化培养 同步化培养参考韩军军等的方法[7]。每5 d更换一半MES培养基[16]，直至培养至试验所需的藻体生物量。

1.2.2 试验光源设定与藻体培养 采用LED复合型白光源，所有光源安装在同一培养架的不同培养层，通过调节各培养层的灯管数量和辐照高度，并采用PLA-20植物光照分析仪测定光照强度，使照射到培养瓶底部的光量子通量密度分别为10、20、40、80和100 μmol·m-2·s-1。取同等质量（0.85±0.01）g预先同步化培养的坛紫菜自由丝状体营养藻丝，转入1 000 mL锥形培养瓶内，将锥形瓶分别置于不同光强条件下充气培养（大气CO2浓度）。每组设置3个平行。培养条件为：光周期12L∶12D，温度（24±0.5）℃，盐度30。每隔5 d更换1次MES培养液，并称量藻体鲜重，培养时间为25 d。

1.2.3 藻体特定生长率的测定 每5 d测定并计算各组样品的特定生长率（Specific Growth Rate，SGR），其计算公式为：SGR（%）=100×（LnST-LnST-5）/5。其中，ST为第T天藻体鲜重，ST-5代表前一次称量时的藻体鲜重。

1.2.4 PSⅡ最大量子效率和主要光合色素含量的测定 采用超便携式调制叶绿素荧光仪MINI PAMⅡ（德国WALZ公司）测定藻体PSⅡ最大量子效率Fv/Fm，方法参考文献[17]。称量新鲜藻体100 mg，暗光于甲醇（100%）溶液中研磨粉碎。4℃避光过夜后离心（10 000 r·min-1，10 min），取上清液。之后用紫外可见分光光度计（UV-3200，日本岛津公司）测定样本的吸光度。叶绿素a（chlorophyll a，Chl.a）和类胡萝卜素（carotenoid，Car）含量的测定分别采用Porra[18]和Parsons等[19]的方法。同时，称量鲜藻100 mg，置于8 mL磷酸缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 6.5）中研磨粉碎，4℃避光过夜后离心（19 000 r·min-1，15 min），取上清液，参考Beer等[20]的方法计算藻红蛋白（phycoerythrin，PE）和藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）含量。

1.2.5 部分光合作用及抗氧化酶活性的测定 坛紫菜自由丝状体营养藻丝的碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase，CA）活性的测定参照Haglund等[21]的方法。样本的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose Bisphosphate Carboxylase，RubisCO）活性测定参照Ronan等[22]报道的非放射性微孔板法。所有处理样品经温化孵育后用Infinite 200 Pro NanoQuant酶标仪（瑞士帝肯公司）测定其在450 nm处的吸光度，绘制标准曲线，并计算酶活力。

称取新鲜藻体100 mg，按照重量（g） ∶体积（mL）=1∶9的比例加入9倍体积的磷酸盐缓冲液，研磨成匀浆后离心（10 000 r·min-1，4℃，10 min），取上清液，参照南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定超氧阴离子自由基和超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 数据处理

试验数据和统计作图采用Excel 2016。利用SPSS 23.0软件对各组数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），差异显著水平设置为P<0.05，数据采用平均值±标准差的表示方式。

2 结果与分析

2.1 坛紫菜自由丝状体营养藻丝的生长曲线与特定生长率

在不同光照强度下，坛紫菜自由丝状体营养藻丝的增重呈现差异。如图1所示，经25 d培养后，光强80 μmol·photons m-2·s-1培养下的藻体增重最多，为5.29 g;10 μmol·photons  m-2·s-1藻体增重最少，仅为2.70 g。光强范围为10～80 μmol·photons m-2·s-1藻体增重整体上趋于随光强增强而增加，而光强增加至100 μmol·photons m-2·s-1时藻体增重下降。不同阶段不同光强下坛紫菜自由丝状体营养藻丝的特定生长率（SGR）也存在差异（表1），在初始培养5 d后测定特定生长率，20 μmol·photons m-2·s-1下SGR最高，100 μmol·m-2·s-1最低，其他组间无明显差异。培养10 d后，10 μmol·photons m-2·s-1下藻体的SGR逐渐降低，整体低于其他试验组;20 μmol·photons m-2·s-1下丝状体的SGR在5 d后一直保持在均衡状态;80 μmol photons·m-2·s-1下丝状体营养藻丝的特定生长率相对于其他试验组保持在中上水平，其中在15～25 d藻体的SGR较高。

2.2 主要光合色素及藻胆蛋白含量

如图2所示，不同光强下坛紫菜自由丝状体营养藻丝的叶绿素a含量存在差异，呈现出随光照强度增强而降低的趋势。其中，10 μmol·photons m-2·s-1培养下的藻体叶绿素a含量最高，為330.11 μg·g-1;100 μmol·photons m-2·s-1组最低，为270.05 μg·g-1，两组间存在显著差异（P<0.05）。与叶绿素a含量的测定结果相类似，类胡萝卜素含量总体上也随光照强度增加而逐渐下降，但光强在10～80 μmol·photons m-2·s-1范围内差异不明显，而当光强增加至100 μmol·photons m-2·s-1时，培养的藻体类胡萝卜素含量显著降低，含量为13.13 μg·g-1，约为20 μmol·photons m-2·s-1光强培养下的1/3（P<0.05）。藻体的藻红蛋白含量也随着光照强度增加而降低（图3），10 μmol·photons m-2·s-1组含量最高，为61.36 mg·g-1，100 μmol·photons m-2·s-1组含量最低，为38.60 mg·g-1。藻蓝蛋白含量最低的是100 μmol·photons m-2·s-1组， 为3.63 mg·g-1，显著低于其他各组。其他各组间藻蓝蛋白含量无显著差异。

2.3 PSⅡ最大量子效率Fv/Fm

如图4所示，坛紫菜自由丝状体营养藻丝在光强40 μmol·photons m-2·s-1下培养，PSⅡ最大量子效率Fv/Fm值最小，为0.668，显著低于其他各试验组。而80 μmol·photons m-2·s-1组的Fv/Fm值显著高于其他各组，为0.741，是40 μmol·photons m-2·s-1组的1.11倍。10和20 μmol·photons m-2·s-1组间的Fv/Fm值无显著差异。

2.4 光合作用及抗氧化相关酶活性

不同光强下培养藻体的CA和RubisCO活性如图5所示，藻体CA和RubisCO的酶活性均随光强增加而呈现先加强后减弱的趋势。在低光强下（10～40 μmol·photons m-2·s-1）随光强增加而提高，高光强（40～100 μmol·photons m-2·s-1）下则反之。其中以40 μmol·photons m-2·s-1培养下的酶活性最强，分别较最低组增加19.39%和13.86%（P<0.05）。

不同光强下藻体的超氧阴离子自由基和SOD活性存在差异（图6），且具有一定的规律性。在10 μmol·photons m-2·s-1光强培养下，藻体的超氧阴离子自由基活性最强，为157.01 U·L-1，随着光强增加，其活性逐渐降低，当光强增至80 μmol·photons m-2·s-1时，其活性最低，为37.74 U·L-1。而在100 μmol·photons m-2·s-1下培养时，酶活性又增强至72.63 U·L-1。与超氧阴离子自由基相类似，藻体的SOD活性也随光强增加而呈现先减弱后增强的趋势。10 μmol·photons m-2·s-1光强培养下活性最强，为22.40 U·L-1。光强80 μmol·photons m-2·s-1下培养活性最低，为5.13 U·L-1。光强继续增强至100 μmol·photons m-2·s-1时，酶活性又增强至9.23 U·L-1。

3 讨 论

特定生长率（SGR）常用于衡量生物体生长状况，SGR 值越大，说明生物体生长越快[23-24]。本研究的结果显示，在光强10～80 μmol·photons m-2·s-1，坛紫菜自由丝状体营养藻丝生长速度随光照强度增加而加快，表现为SGR值升高。这与张前前等在硅藻研究中发现的结果相一致[25]。但是，随着光照强度的持续增加，在100 μmol·photons m-2·s-1光强下培养的藻体生长减缓。这表明光照过强会对藻体的生长产生一定的抑制作用。正常生理状态下，Fv/Fm是一个较稳定的值，反映了植物体潜在的最大光合活性，与生长速度之间存在一定的相关性。本研究中，最大量子效率Fv/Fm值总体上随光强增加呈现先增加后降低的趋势，其中80 μmol·photons m-2·s-1光強培养下的Fv/Fm值最大，表明该光强下的植物潜在光合作用活性最强，这也与藻体SGR的结果相类似。与野生型坛紫菜丝状体不同的是，野生型坛紫菜丝状体营养藻丝在较高光强（78 μmol·photons m-2·s-1）下的实际量子效率（Y）和最大相对电子传递速率（rETRmax）均会显著下降[15]，这可能与人工选育的新品种申福2号丝状体种质长期处在LED光照环境下扩大培养，营养藻丝自身赋予了更高的光适应能力有关。

本研究中，坛紫菜自由丝状体营养藻丝在弱光条件培养下，藻体叶绿素a、类胡萝卜素及藻红蛋白含量均表现出较高的水平，但当光照过强（100 μmol·photons m-2·s-1）时，则含量显著性下降。藻蓝蛋白含量在100 μmol·photons m-2·s-1组同样最低，但其他各组间差异不明显。以往的研究已经证实，低光强下培养的海藻光合色素含量上升，光合作用单元和PSⅡ反应中心数量会增多，这有助于藻体对光能的捕获和传导，而当光照过强时，藻体吸收的光能超过光合作用所需时，过多的光能使海藻处于胁迫状态，藻体光合色素含量也相应降低[15，26]，这是一种植物体常见的光适应策略。

RubisCO和CA是植物光合作用和CO2浓缩机制中的两个关键酶，可以调节光合反应的CO2同化和光呼吸，并在一定程度上影响植物体的光合速率[27]。本研究中，这两种酶的活性同样随光强递增而呈现出先增强后减弱的趋势，其中，以40 μmol·photons m-2·s-1光强下活性最高，80 μmol·photons m-2·s-1培养下也表现出较高的酶活性。超氧阴离子自由基是逆境胁迫下最早形成的自由基种类，过高的自由基含量往往会造成细胞质膜损伤，引起膜系统的瘫痪，从而导致代谢功能丧失[28]。SOD是生物体细胞内清除超氧阴离子自由基的一种特异酶，其活性与超氧阴离子自由基存在一定的相关性，当植物体受到环境胁迫时，往往会表现出较高水平的超氧阴离子自由基[29-31]。研究结果显示，80 μmol·photons m-2·s-1培养下的坛紫菜自由丝状体营养藻丝的超氧阴离子和SOD活性最低，说明该光强培养下的坛紫菜丝状体营养藻丝生长状况良好，不存在典型的环境胁迫效应。

4 结 论

本研究中，80 μmol·photons m-2·s-1培养下的坛紫菜自由丝状体营养藻丝，在各试验组中藻体的增重最多，最大量子效率Fv/Fm值最大，RubisCO和CA酶活性较强，超氧阴离子和SOD活性最低。这表明80 μmol·photons m-2·s-1是最有利于坛紫菜自由丝状体营养增殖的光照强度。

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（责任编辑：林海清）