安徽无花果炭疽病病原鉴定及对杀菌剂的敏感性

李丹丹 刘灿 叶磊 乔慧君 檀根甲

摘要 采集安徽田间典型发病症状的样品，通过组织分离法从无花果病叶和病果上分离获得10个菌株，采用形态学方法和分子生物学方法鉴定并进行致病性测定和柯赫氏法则验证。结果表明，所分离的10个菌株均为胶胞炭疽（Colletotrichum gloeosporioides），其中K7菌株的致病性最强。采用菌丝生长速率法和含毒介质法测定了多菌灵、苯甲·丙环唑、苯甲·嘧菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺等7 种杀菌剂对无花果炭疽病菌K7菌株的抑制作用。其中苯丙甲环唑和咪鲜胺对K7菌株的菌丝生长抑制效果最好，EC50值分别为0.011 2和0.013 0 μg/ml。该研究为无花果炭疽病菌的鉴定和高效防治提供了理论依据。

关键词 无花果;病原菌鉴定;胶孢炭疽菌;杀菌剂

中图分类号：S436.639 文献标识码：A 文章编号：2095-3305（2019）06-014-04

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.06.007

Isolation and Identification of the Pathogen in Fig Anthracnose and Bioactivity of 7 Fungicides Against This Pathogen

LI Dan-danet al（College of Plant Protection，Anhui Agricultural University，Key Laboratory of biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes，Hefei，Anhui 230036）

Abstract Samples with typical symptom were collected from the field in Anhui Province and then 10 strains were isolated from leaf and fruit by tissue separation method. The pathogen of fig anthracnose was identified by morphological and molecular biological methods and the pathogenicity of pathogen was tested by Koch’s law. The results showed that the 10 strains were Colletotrichum gloeosporioides，and the K7 was the most virulent strain. Based on mycelial growth method and the toxic medium method，the inhibitory activity of carbendazim，difenoconazole·propiconazole，difenoconazole·azoxystrobin，tebuconazole，pyraclostrobin，difenoconazole and prochloraz against the fig anthraces K7 strain were determined. Among them，difenoconazole and prochloraz had the most satisfactory activity against the mycelial growth of K7 strain，and the EC50 values were 0.011 2 μg/ml and 0.013 0 μg/ml，respectively. This study provided a theoretical basis for understanding the pathogen diversity and chemical control of fig anthracnose.

Key words Fig; Identification; Colletotrichum gloeosporioides;Fungicide

無花果（Ficus carica）属桑科榕属无花果亚属，原产于地中海，落叶灌木或小乔木，花隐生于囊状花托内，为隐头花序，故名无花果[1]。无花果果实柔软味甜，含有人体需要的18种氨基酸、多种维生素和微量元素及丰富的食物纤维，具有较高的药用价值和营养价值。其性味甘平，能吸附肠道内有害物质，促进肠道内有益菌类繁殖，维持正常的血糖和胆固醇含量，提高人体免疫力和抗衰老、抗病能力，且具有减肥美容的功效[2]。美国和日本已经将无花果定位为抗癌食品，无花果果干、无花果茶饮品等均已上市，应用前景十分广阔。

无花果炭疽病是由胶孢炭疽菌 [Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.]引起的一种真菌性病害，随着无花果产业扩大和气候变化，该病已经成为影响无花果产量和品质的重要病害。胶孢炭疽菌寄主范围广，除侵染大田作物外，还可危害无花果、桃、梨、葡萄和柑橘等多种果树。当空气湿度大时，无花果树易发生炭疽病，随着树龄增加，果园郁闭，该病发生概率大，成为无花果生长期和采后贮藏期的重要病害，严重影响果实品质和产量[3]。合肥市作为目前安徽省最大的无花果露地栽培基地，无花果种植面积逐年增加，主要的栽培品种为108B、白山口、马斯依淘芬、金奥芬、121E、芭劳奈、波姬红、118D和青皮。据笔者调查，该病在合肥市无花果种植基地发病率达到50%～80%，不仅危害了无花果产量与质量，而且严重影响了无花果采后贮藏和销售[4]。目前，对无花果炭疽病及其病原的研究尚少[3-4]，笔者对合肥市无花果炭疽病进行了病原菌分离鉴定，并测定7种杀菌剂对无花果炭疽病菌的抑制作用，以期为深入了解无花果炭疽病菌的致病性和化学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料来源 病样采于安徽省肥西县官亭镇无花果产区，采用品种为108 B的无花果发病病叶和病果。将病叶和病果保存于密封袋中带回实验室，用于后续试验研究，拍照并记录发病叶片和病果的主要特征。

1.1.2 供试药剂 98%多菌灵原药（宁国市朝农化工有限公司）;97%戊唑醇原药（安徽众邦生物工程有限公司）;97%吡唑醚菌酯原药（巴斯夫欧洲公司）;98%苯醚甲环唑原药;97%咪鲜胺原药（青岛海纳生物科技有限公司）;300 g/L苯甲·丙环唑乳油（瑞士先正达作物保护有限公司）;30%苯甲·嘧菌酯悬浮剂（安徽丰乐农化有限责任公司）。

1.1.3 供试引物 试验所用引物如表1所示。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离、纯化 采用组织分离法[5-7]，切取病叶和病果的病健交界处组织块，放入75%酒精中消毒20～30 s，然后转入0.1%的升汞溶液中消毒1～2 min，最后用无菌水冲洗3次，转移至含有链霉素的PDA平板上，27℃恒温培养箱中黑暗培养5 d左右，纯化后用单孢分离法挑取单孢转入试管斜面培养基中培养并保存。

1.2.2 柯赫氏法则验证 选取健康的无花果叶片、叶柄和果，用75%酒精进行表面消毒，后用无菌水冲洗干净，采用人工接种方法测定病原菌的致病性。具体操作如下：用0.05%吐温20溶液洗下PDA平板中孢子，在显微镜下调整孢子悬浮液浓度为1×107个/ml;用灭菌的大头针均匀地刺伤叶片、叶柄和果实，将孢子悬浮液均匀地喷洒在其表面，每个处理3次重复，设置无菌水对照。上述所有处理用保鲜膜包裹，放置于人工气候箱中28℃光照培养，每天观察发病情况并拍照记录。

1.2.3 病原菌的形态学鉴定 将分离纯化的单孢培养物用直径5 mm打孔器制成菌饼，接种到PDA平板中央，27℃恒温培养箱黑暗培养，每天观察菌丝生长情况及菌落形态变化。待菌落成熟并产孢，用0.05%吐温20洗下孢子，取分生孢子悬浮液滴在玻片上，在显微镜下观察分生孢子的形态特征并记录分生孢子的大小[7]。采用玻片萌发法诱导附着胞的产生，观察附着胞的形态特征。

1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定 分离纯化病原菌后对病原菌进行分子生物学鉴定。采用CTAB法分别提取各菌落的DNA[8]，对病原菌的核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）、肌动蛋白基因（actin，ACT）、β微管蛋白基因（βtubulin，TUB2）、几丁质合成酶A基因（chitin synthase A，CHS1）、3磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehydes3phosphate dehydrogenase，GAPDH）和鈣调蛋白基因（calmodulin，CAL）进行PCR扩增。PCR反应总体系为25 μl，包括DNA模板1 μl，正反向引物各1 μL，2×Master Mix 12.5 μl，以9.5 μl ddH2O补足至25 μl。反应程序见表1。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将具有目的条带的产物送擎科生物科技公司进行测序，将测序结果在NCBI网站上与GenBank数据库中已知的rDNA序列比对，并下载含有ITS、ACT、GAPDH、TUB2、CHS1和HIS3等6种基因的炭疽属模式菌株作为参考序列进行多位点系统遗传学分析建树系。用EditSeq软件将各基因按照ITSACTCALCHS1TUB2GAPDH的顺序连接，用mafft 2.7和Clustal 2.0将序列进行比对并校正，用MEGA6.0软件，采用最大似然法构建系统发育树，以自展法进行检测，循环1 000次，构建供试菌株的系统发育进化树。

1.2.5 杀菌剂对病原菌的毒力测定 采用含毒介质法[9]，选取病原菌活化后接种到PDA上，恒温黑暗培养5 d后待用。准确称取药剂，将多菌灵、苯甲·丙环唑、苯甲·嘧菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺，分别配制成1、10、25、50和100 μg/ml浓度，用丙酮稀释原药，无菌水和丙酮作为对照。将培养基按照药与培养基1∶10比例配好，用移液枪取出1 ml药液于90 mm培养皿中，再取9 ml融化好的PDA培养基混合均匀，然后倒平板，放置凝固后备用。将培养好的病菌用直径5 mm 打孔器打取菌饼，每个含药平板中心接入菌饼，每个处理均设3个平板重复。接种菌饼后放入27℃恒温箱中，培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径，相对抑制率 =（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。用DPS V7.05版软件对药剂浓度、抑制率求得杀菌剂毒力回归方程、EC50、EC90及95%置信限。

2 结果与分析

2.1 症状描述

试验样品采于2017年9月，分别收集无花果发病的叶片、叶柄及果实，症状如图1所示。叶片中一部分发病的叶片背面沿叶脉散布褐色病斑（图1a），另一部分叶片，在叶片正面边缘处散布淡黄色病斑，病斑中间为褐色坏死病斑（图1b）;叶柄感病初变暗褐色，后病斑逐渐扩大，中间颜色呈深褐色，边缘处颜色较淡（图1c）;发病果实表面呈现圆形或椭圆形的褐色斑块，病斑中间处凹陷颜色较淡，病斑边缘颜色较深（图1d）。

2.2 病原菌分离

通过组织分离法，从叶片、叶柄及果实病样上分离得到10个菌株，将其纯化用于后续试验。

2.3 病原菌致病性与柯赫氏法则验证

将分离得到的10个菌株接种到健康的叶片、叶柄和果实上，3 d后不同接种部位都出现了与田间自然发病一致的症状，其中K7菌株的致病性最强。叶片正面散布中心为深褐色边缘为淡黄色坏死斑，有明显的黄色晕圈（图1e）。叶片背面深褐色病斑沿叶脉扩展（图1f），叶柄感病后伤口部位变暗褐色后病斑逐渐扩大，感病部位稍凹陷（图1g）。发病果实表面呈现圆形褐色斑块，病斑中间处颜色较淡，病斑边缘颜色较深（图1h）。对病斑组织再次进行病原菌分离，分离所得菌落与原接种菌落形态特征一致，且分生孢子形态特征也完全一致，符合柯赫氏法则。试验中所有空白对照均未发病，也没有分离到病原菌（图1i～k）。综上可以确定，试验中分离所得的菌株确实为引起无花果炭疽病的病原菌。

2.4 病原菌形态学鉴定

通过组织分离法，从病样上纯化并进行单胞分离得到10株病原菌，将各菌株编号后观察菌落形态。菌落在PDA培养基上培养5 d后，菌落呈圆形，边缘整齐，菌落生长初期为白色，随着生长菌落中间由白色逐渐变为灰色到深灰色，菌落光滑、蓬松。当菌落长满培养皿后，中间可见橘红色黏状孢子团（图2a）。用0.05%吐温20洗下菌落的孢子，于光学显微镜下觀察。各菌落的分生孢子形态特征基本相同，分生孢子呈长椭圆形、透明，大小为（7.5～12.0） μm×（2.0～5.5） μm，孢子中间有油滴状透明圆圈（图2b）。利用玻片萌发法诱导附着胞的产生，附着胞褐色呈吸盘状，中间有白色圆圈（图2c）。根据以上对真菌的形态特征描述，鉴定分离的10个菌株均为炭疽菌（Colletotrichum） [10]。

2.5 病原菌分子生物学鉴定

对10个菌株的ITS、ACT、CAL、CHS1、TUB2和GAPDH基因进行扩增，得到长度分别为555、240、690、300、750和580 bp的片段（图3）。序列扩增测序后，与参考基因进行比对，构建最大似然分析生成的系统发生树（图4）。系统发育树显示，病原菌与炭疽属模式菌株中的C. gloeosporioides聚为一个进化枝，其支持率为98%。结合病原菌的形态特征与多基因系统发育树，确定无花果炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

2.6 杀菌剂对菌株K7菌丝生长的抑制作用

由表2可以看出，7种杀菌剂对病原菌都有抑制作用，其中苯醚甲环唑和咪鲜胺对病原菌的菌丝生长抑制作用最好，EC50值分别为0.011 2和0.013 0 μg/ml，其次是多菌灵，EC50值为0.592 0 μg/ml，其他药剂苯甲·丙环唑、苯甲·嘧菌酯、戊唑醇和吡唑醚菌酯的EC50值分别为1.243 2、4.845 1、3.790 3和6.420 8 μg/ml。

3 讨论

该试验对安徽省肥西县官亭镇无花果产区108 B品种的无花果病叶和病果进行病原菌的分离纯化，分离菌株经柯赫氏法则验证为无花果炭疽病的病原菌。通过对病原菌的形态学观察，发现其与张雪丹在威海无花果炭疽病病原鉴定及杀菌剂毒力测定中所描述的胶孢炭疽形态特征基本一致[4]。将病原菌的ITS、ACT、CAL、CHS1、TUB2和GAPDH 6种基因连接并进行系统发育分析，发育树结果显示该病原菌与炭疽菌属胶孢炭疽复合种下的胶孢炭疽模式菌株在一个分枝上，聚为一个进化枝并且支持率为98%，与Weir所报道的无花果炭疽病症状一致[10]，结合病原菌形态学特征和多基因系统发育分析可确定引发无花果炭疽病的病原菌为胶孢炭疽复合种下的胶孢炭疽C. gloeosporioies。

在进行室内回接试验时发现，回接初期叶片及果实上出现退绿斑点，发病症状不明显，不易观察，在回接12 h后，病斑迅速扩展，叶片及果实发病严重。田间果实感病初期症状不明显，不易察觉，果实接近成熟时病斑会迅速扩展，田间发病明显加重，此时已经无法有效进行病害的防控工作，所以对病害的早期准确诊断是防止病害发生、扩展的前提。

近年来无花果的栽植品种和种植规模不断增加，同时无花果炭疽病也在逐年加重，这给果农带来巨大的经济损失。化学防治是防治无花果炭疽病的主要手段，该试验对多菌灵、苯甲·丙环唑、苯甲·嘧菌酯、戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和咪鲜胺等7种药剂进行毒力测定，结果显示7种杀菌剂对病原菌均有较好的抑制作用，其中苯丙甲环唑和咪鲜胺对菌丝生长抑制作用最好，EC50值分别为0.011 2和0.013 0 μg/ml。该研究为无花果炭疽病的针对性防治提供了理论依据。

为实现无花果炭疽病的高效综合防治，种植基地要合理密植、通风，农事操作中尽量避免造成伤口，防止病原菌的侵入，同时采用合理高效的化学药剂有效控制病害的发生和蔓延。

参考文献

[1] 古丽尼沙·卡斯木. 11个引进无花果品种抗寒性研究[J]. 西北林学院学报，2018，33（3）：98-105.

[2] 张艳，于春霞.邹平县无花果产业发展状况与保护地栽培技术[J]. 落叶果树，2018，50（3）：49-51.

[3] 赵杰.无花果炭疽病菌生物学特性及药剂的毒力测定[J]. 北方园艺，2016（14）：126-129.

[4] 张雪丹.威海无花果炭疽病病原鉴定及杀菌剂毒力测定[J]. 江西农业学报，2012，24（5）：53-54.

[5]WANG Y C，HAO X Y，WANG L，et al. Diverse Colletotrichum species cause anthracnose of tea plants （Camellia sinensis （L.） O. Kuntze） in China [J]. Scientific Reports，2016（6）：35287.

[6] 方中达.植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1998：122-127.

[7] 韦荣昌.田七炭疽病病原的分离与鉴定[J]. 江苏农业科学，2017，45（10）：86-88.

[8] 李娜.炭疽病病原种类及群体遗传多样性研究[D]. 温江：四川农业大学，2012.

[9] 范昆，张雪丹，余贤美，等.无花果炭疽病菌的生物学特性及8种杀菌剂对其抑制作用[J].植物病理学报，2013，43（1）：75-81.

[10] WEIR B S. The Colletotrichum gloeosporioides species complex [J]. Studies in Mycology，2012，73（1）：115-180.

责任编辑：郑丹丹