不同种植模式七叶一枝花土壤芽胞杆菌多样性研究

苏海兰 郑梅霞 朱育菁 单寄坪

摘 要：【目的】分析水稻田、山垅和林下3种种植模式七叶一枝花土壤中芽胞杆菌资源多样性，为七叶一枝花的栽培提供理论基础。【方法】采用五点采样法，分别采集水稻田、山垅田与林下种植模式七叶一枝花根际土壤与非根际土壤样本6份，采用涂布法分离芽胞杆菌，采用16S rRNA基因同源性将其鉴定。【结果】一共分离获得了87株芽胞杆菌，13个属、35个种，分别属于芽胞杆菌属Bacillus的16个种、赖氨酸芽胞杆菌属Lysinibacillus、类芽胞杆菌属Paenibacillus和假单胞菌属Pseudomonas的各3个种、Bhargavaea、短杆菌属Brevibacterium、Burkholderia、短芽胞杆菌属Brevibacillus、代夫特菌属Delftia、Paenarthrobacter、节杆菌属Arthrobacter、伯克氏菌属泛菌属Pantoea、假单胞菌属Pseudomonas的各1个种。根据分离频度分析得知，七叶一枝花土壤中的芽胞杆菌优势菌群为图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis和假蕈状芽胞杆菌B. pseudomycoides。其中，水稻田种植模式土壤中的芽胞杆菌的数量最多，且Margalef、Shannon-Wiener、Pielou和Simpson多样性指数都最高。七叶一枝花根际土壤中的芽胞杆菌数量均大于非根际土壤。【结论】水稻田蕴藏着丰富的芽胞杆菌种类和数量，多样性高，在七叶一枝花的种植中具有很好的应用前景。

关键词： 芽胞杆菌;七叶一枝花;种植模式;多样性;分离频度

中图分类号：Q 938文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）08-974-11

Abstract：【Objective】Distribution and diversity of Bacillus-like bacteria in soil of Paris polyphylla cultivation fields were studied. 【Method】 Using the five-points sampling methodology， soil specimens were collected from the rhizosphere and non-rhizosphere on the rice paddy， mountain ridge， and understory fields in Nanping， Fujian where P. polyphylla was cultivated. The bacteria were isolated using smear culture on petri dishes followed by 16S rRNA gene sequencing for identification. 【Result】 Of the 87 isolates obtained from 6 soil specimens， 35 belonged to 13 genera of Bacillaceae. They included 16 species of Bacillus， 3 species each of Lysinibacillus， Paenibacillus， and Pseudomonas， and one species each of Bhargavaea， Brevibacterium， Burkholderia， Brevibacillus， Delftia， Paenarthrobacter， Arthrobacter， Pantoea， and Pseudomonas. According to the frequencies of these microbes appeared in the isolation process， the dominant Bacillus spp. in the cultivation soils were B. toyonensis and B. pseudomycoides. Among the different field types， the paddy soil held the greatest quantity of Bacillus spp. as well as the highest Margalef， Shannon-Wiener， Pielou， and Simpson diversity indices. And， the rhizosphere soil was richer in the population than non-rhizosphere soil at all sites. 【Conclusion】 Paddy soil was rich and diverse in Bacillus-like bacteria which would benefit the cultivation of P. polyphylla.

Key words：Bacillus spp.; Paris polyphylla; cultivation fields; diversity; isolation frequency

0 引言

【研究意義】植物根际是土壤-植物生态系统物质交换的环境，土壤细菌既是土壤微生物区系的重要组成部分，也是土壤物质流和能量流的主要推动者，其中芽胞杆菌抗逆性强，是土壤和植物微生态的优势微生物种群[1]。七叶一枝花具有止血、镇静止痛和免疫调节等作用，随着需求量日益增加，人工栽培是解决七叶一枝花供需矛盾和保护野生资源的有效途径[2]。其中，地理环境、栽培条件及根际土壤微生物数量影响七叶一枝花的生长及药用价值[2-4]。药用植物产生的次级代谢产物很丰富，在其生长过程中很容易将这类物质释放到土壤中，从而引起药用植物根际土壤理化性质的改变，导致根际微生物和土壤酶活性较非根际有更大的变化[5]。七叶一枝花与根际土壤微生物共生[1]，生产上七叶一枝花的栽培需要良好的土壤微生态环境，为此研究适宜七叶一枝花栽培模式的芽胞杆菌多样性群落对促进生产具体重要意义。【前人研究进展】崔莹等[6]报道八门湾红树林土壤样品中Bacillus为优势属;周秋平等[7]报道热带雨林土壤样品中其中优势属为Bacillus;葛慈斌等[8]报道武夷山自然保护区土壤样品中Bacillus为优势属。【本研究切入点】七叶一枝花土壤中芽胞杆菌细菌群落的多样性研究较少，不同生境的七叶一枝花根际与非根际细菌群落的结构及多样性分析比较有待阐明。【拟解决的关键问题】本研究对福建省南平地区水稻田、山垅和林下3种不同种植模式下七叶一枝花根际与非根际土壤芽胞杆菌群落结构及多样性进行初步研究，了解七叶一枝花与土壤微生物之间的相互作用，为探讨通过调控土壤微生物实现七叶一枝花优质高产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤样品于2018年5月采集于福建省南平市光泽县福建承天农林科技发展有限公司七叶一枝花水稻田、山垅田与林下3种种植模式七叶一枝花根际土与非根际土壤，采用5点采样法采集，装入灭菌袋，采集后马上带回实验室，经风干、过筛后，装瓶保存备用。

1.2 土壤中细菌的分离与保存

称取土壤样品10 g，加入到装有90 mL无菌水的锥形瓶（150 mL）内，振荡30 min后，80℃水浴10 min，中间震荡2～3次，即制成10-1土壤悬液，再逐级稀释至10-2、10-3;吸取各梯度的土壤悬液100 μL，分别滴加到LB培养基平板上，溶液滴至平板中央，用无菌涂布棒涂匀并静置1 h，使溶液完全渗透进平板，每个浓度梯度3个重复。涂布后的平板30℃恒温培养2 d，根据各平板上菌落的形态、大小、颜色、表明干湿情况、边缘状态和透明度等特征区分不同的菌落类别，分别编号和统计数量，挑取不同类型的单菌落在新的LB培养基平板上进行纯化，直至获得纯培养，保存备用。每克土壤中芽胞杆菌的数量=同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数/土壤克数。

1.3 分子鉴定与系统发育分析

参照葛慈斌等[8]的方法，对获得纯培养的不同菌落类型芽胞杆菌进行DNA提取和16S rRNA基因序列PCR扩增，扩增产物由上海博尚生物技术有限公司进行测序。将测得的序列在Ez Taxon （http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）进行比对，初步确定各菌株的分类地位;并结合各菌株的菌落形态及方法1.2中对不同类型菌落的计数结果，统计每个土壤样品中分离出的同一种芽胞杆菌的数量及3个地点所有土壤样品中分离出芽胞杆菌的种类和数量。根据对分离得到的芽胞杆菌16S rRNA基因序列测定的结果，选取不同芽胞杆菌的16S rRNA基因序列，并选择相关参考菌株（模式菌株）的相应基因序列，经Clustal X对齐后，用软件Mega 6.0进行聚类分析，构建Neighbor-joining系统发育树。

1.4 生境分布多样性分析

分离频度是指某种芽胞杆菌在某个种植模式土壤样品中被分离到的频率，即分离频度/%=（某个种出现的样品数/总样品数）×100。分离频度大于50%为优势种，介于30%～50%的为最常见种，介于10%～30%的为常见种，小于10%的为稀有种。根据对芽胞杆菌进行鉴定的结果，统计所有种类芽胞杆菌在不同种植模式土壤样品中的分离频度和数量，分析其生境分布的多样性。

1.5 群落结构多样性分析

采用常用的多样性指数[9]计算公式如下：

其中，S表示某个种植模式土壤中细菌的种类数，N表示某个种植模式土壤中芽胞杆菌的总量，Pi表示第i种芽胞杆菌的数量占该种植模式土壤中芽胞杆菌总数的比例（即Pi=Ni/N，Ni为第i种芽胞杆菌的数量）。

2 结果与分析

2.1 细菌种类采集与鉴定

从水稻田、山垅田、林下采集的6份土壤样品中分离、保存芽胞杆菌87株;经16S rRNA基因序列测定、比对，可初步将这87个菌株鉴定为13个属35个种（表1），其中部分典型的芽胞杆菌的菌落形态如图1所示。在这35个种中，芽胞杆菌属的种最多，有16种，占种总数的45.71%;其次是赖氨酸芽胞杆菌属Lysinibacillus、类芽胞杆菌属Paenibacillus和假单胞菌属Pseudomonas各有3种;Bhargavaea、短杆菌属Brevibacterium、Burkholderia、短芽胞杆菌属Brevibacillus、代夫特菌属Delftia、Paenarthrobacter、节杆菌属Arthrobacter、伯克氏菌属泛菌属Pantoea、假单胞菌属Pseudomonas均只有1种。

在水稻田七叶一枝花的非根际土（SDF）分离到17株细菌，含4个属，12个种。其中，芽胞杆菌属8个种：高地芽胞杆菌B. altitudinis、阿氏芽胞杆菌B. aryabhattai、扁平芽胞杆菌B. depressus、钻特省芽胞杆菌B. drentensis、太平洋芽胞杆菌B. pacificus、图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis、短杆菌Brevibacterium frigoritolerans、假蕈状芽胞杆菌B. pseudomycoides;赖氨酸芽胞杆菌属2个种：赖氨酸芽胞杆菌L. mangiferihumi 和L. fusiformis;短芽胞杆菌属1个种：耐寒芽胞杆菌B. frigoritolerans;Paenarthrobacter的1个种：P. ilicis;类芽胞杆菌属1个种：P. silvae。

在水稻田七叶一枝花的根际土（SDG）分离到18株芽胞杆菌，含3个属，14个种。其中，芽胞杆菌属10个种：图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis、假蕈状芽胞杆菌B. pseudomycoides、阿氏芽胞杆菌B. aryabhattai、高地芽胞杆菌B. altitudinis、白色杆菌B. albus、泰门芽胞杆菌B. timonensis、钻特省芽胞杆菌B. drentensis、B. mobilis、科研中心芽胞杆菌B. cecembensis和扁平芽胞杆菌B. depressus;类芽胞杆菌属2个种：乐金类芽胞杆菌P. elgii和蜂房类芽胞杆菌P. alvei;赖氨酸芽胞杆菌属2个种：解木糖赖氨酸芽胞杆菌L. xylanilyticus和纺锤形赖氨酸芽胞杆菌L. fusiformis。

在林下七葉一枝花的非根际土（LXF）分离到12株芽胞杆菌，含6个属，8个种。其中，芽胞杆菌属3个种：B. paramycoides、B. proteolyticus和图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis;代夫特菌属1种：胡生代夫特菌D. lacustris;赖氨酸芽胞杆菌属1个种：解木糖赖氨酸芽胞杆菌L. xylanilyticus;类芽胞杆菌属1个种：蜂房类芽胞杆菌P. alvei;短芽胞杆菌属1种：侧胞短芽胞杆菌B. laterosporus;伯克氏菌属1种：稳定伯克霍尔德菌B. stabilis。

在林下七叶一枝花的根际土（LXG）分离到11株芽胞杆菌，含4个属，7个种。其中，芽胞杆菌属3个种：假蕈状芽胞杆菌B. pseudomycoides、B. paramycoides和图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis;赖氨酸芽胞杆菌属1个种：解木糖赖氨酸芽胞杆菌L. xylanilyticus;假单胞菌属2个种：霍氏假单胞菌P. rhodesiae和基尔假单胞菌P. koreensis;Bhargavaea的1个种：B. ginsengi。

在山垅七叶一枝花的非根际土（SLF）分离到12株芽胞杆菌，含3个属，8个种。其中，芽胞杆菌属6个种：图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis、假蕈状芽胞杆菌B. pseudomycoides、赛门枝芽胞杆菌B. siamensis、阿氏芽胞杆菌B. aryabhattai、B. albus和维德曼芽胞杆菌B. wiedmannii;假单胞菌属1个种：P. granadensis;泛菌属1种：P. rodasii。

在山垅七叶一枝花的根际土（SLG）分离到17株芽胞杆菌，含5个属，16个种。其中，芽胞杆菌属9个种：B. proteolyticus、B. albus、图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis、维德曼芽胞杆菌B. wiedmannii、高地芽胞杆菌B. altitudinis、阿氏芽胞杆菌B. aryabhattai、吉氏芽胞杆菌B. gibsonii、扁平芽胞杆菌B. depressus和假蕈状芽胞杆菌B. pseudomycoides;假单胞菌属2个种：P. koreensis 基尔假单胞菌，霍氏假单胞菌P. rhodesiae;赖氨酸芽胞杆菌属1个种：纺锤形赖氨酸芽胞杆L. fusiformis;代夫特菌属1个种：D. acidovorans;绿芽胞杆菌属1个种：田地绿芽胞杆菌V. arvi;节杆菌属1个种：A. bambusae。

2.2 芽胞杆菌资源系统发育

采用Neighbour-Joining方法对从七叶一枝花土壤中分离到的芽胞杆菌和35株参考菌株构建进化树，如图2所示，主要聚为2大类。第1大类群为芽胞杆菌科的种类，包括芽胞杆菌属Bacillus、短杆菌属Brevibacillus、Bhargavaea、绿芽胞杆菌属Viridibacillus、赖氨酸芽胞杆菌属Lysinibacillus、短芽胞杆菌属Brevibacillus、Paenarthrobacter和节杆菌属Arthrobacter;第2大类群为非芽胞杆菌科，包括代夫特菌属Delftia、伯克氏菌属Burkholderia、泛菌属Pantoea和假单胞菌属Pseudomonas。

2.3 芽胞杆菌类群的生境分布

对3种种植模式的七叶一枝花土壤中分离出的芽胞杆菌的分离频度、数量进行分析（表2）， 结果表明图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis和假蕈状芽胞杆菌B. pseudomycoides为土壤中芽胞杆菌的优势种。

不同种植模式土壤中芽胞杆菌的优势种存在差别：B. altitudinis、B. pseudomycoides、B. drentensis、B. aryabhattai、L. fusiformis、B. depressus和B. toyonensis为水稻田土壤中细菌的优势种，B. pseudomycoides、B. aryabhattai、B. toyonensis、B. albus和B. wiedmannii为山垅田的优势种，B. toyonensis、L. xylanilyticus和B. paramycoides为林下的优势种。B. pseudomycoides和B. toyonensis这2个种在3种种植模式的土壤样品中均有分离到，是该地区土壤中广泛存在的细菌。但也有相當部分的种类只在1个种植模式地点的土壤中分离到，为该地点的特有种类，如B. frigoritolerans、B. drentensis、L. mangiferihumi、B. pacificus、P. ilicis、P. silvae、B. timonensis、B. mobilis、P. elgii和B. cecembensis等10个种只在水稻田有分离到，B. siamensis、P. granadensis、B. wiedmannii、Pantoea rodasii、A. bambusae、B. gibsonii、D. acidovorans和V. arvi等8个种只在山垅田有分离到，B. paramycoides、D. lacustris、B. laterosporus、B. stabilis、B. ginsengi等5个种在林下有分离到。

不同种植模式地点土壤中芽胞杆菌数量存在差异：林下芽胞杆菌数量最少，只有32.5×105 cfu·g-1，水稻田土壤中最多，达36.4×105cfu·g-1。不同地点土壤中数量较多的芽胞杆菌种类也不一样，如水稻田土壤中数量最多的芽胞杆菌是B. pseudomycoides，山垅田土壤中数量最多的芽胞杆菌是A. bambusae，林下土壤中数量最多的芽胞杆菌是B. toyonensis。

3种种植模式地点的七叶一枝花的根际土的芽胞杆菌数量均大于非根际土壤中芽胞杆菌的数量。

2.4 芽胞杆菌多样性

3种种植模式七叶一枝花土壤中芽胞杆菌的物种多样性如图3所示。水稻田种植的七叶一枝花土壤中芽胞杆菌的物种丰富度指数最高，为3.05，山垅田种植的七叶一枝花土壤其次，为2.92，林下种植的七叶一枝花土壤的物种丰富度最低，仅为1.90。水稻田种植的七叶一枝花土壤中芽胞杆菌的物种多样性指数最高，达2.52，山垅田其次，为2.09，林下最低，为1.83。水稻田种植的七叶一枝花的土壤中芽胞杆菌均匀度指数和优势度指数最高，分别为0.72和0.77。

3 讨论与结论

芽胞杆菌是典型的土壤微生物，能够利用植物根系的分泌物和脱落物进行快速生长繁殖，所以可以从植物根际中分离获得[10]。土壤中的芽胞杆菌可作为生物肥料和生物农药[11]。巨大芽胞杆菌等可降解、活化土壤中難溶的含磷化合物，使之成为作物易吸收的可溶形态[12];巨大芽胞杆菌和球形芽胞杆菌具有固氮作用，可以提高固氮菌在水稻根表的定殖能力[13];苏云金芽胞杆菌形成过程中可以产生一种对鳞翅目、双翅目和鞘目幼虫具有高毒力的伴孢晶体，有杀虫效果[14];枯草芽胞杆菌能防治植物病害和促进植物生长[15]。本研究较系统地分析了南平市光泽县福建承天农林科技发展有限公司不同种植模式七叶一枝花土壤中芽胞杆菌的群落状况，结果表明水稻田土壤中芽胞杆菌种类丰富、数量最大，其次为山垅田，最后为林下。水稻田土壤微生物多样性是构成土壤生态功能的基础，是土壤生态系统中C、N、S、P等物质和能力循环的主要参与者[16]，是土壤中微生物群落演替与土壤有机碳动态协同反馈[17]。施用化肥会影响碳氮转化[18]，影响水稻田土壤的微生物多样性[19]。林下土壤微生物多样性低可能是因其为种植时间较长的竹子林，林下植物多样性低，主要植物已与土壤微生物形成稳定的微生物生态系统。3种种植模式的七叶一枝花根际土壤中芽胞杆菌的数量和多样性高于非根际土壤。因为植物根系代谢产生分泌物，其中一些物质可直接影响根际土壤细菌生长、发育和繁殖，使根际细菌数量、种类不同于非根际土壤，形成根际效应[20]，如安韶山等[21]报道了宁南山区9种典型植物的根际土壤中微生物多样性指数和微生物均匀度指数均比非根际土壤高;李岩等[22]报道了黑枸杞根际土壤中细菌的多样性高于非根际土壤。 南平市光泽县福建承天农林科技发展有限公司3种种植模式的土壤中的芽胞杆菌优势菌群为图瓦永芽胞杆菌B. toyonensis和假蕈状芽胞杆菌B. pseudomycoides，其中图瓦永芽胞杆菌是一种益生菌[23]，可减少病原体[24];假蕈状芽胞杆菌具有固氮能力，可产纤溶酶[25]、丙氨酸消旋酶[26]和用于生物防治的黄曲霉毒素[27]。另外，在七叶一枝花的根际土壤中，共分离到26种可培养的芽胞杆菌，种类丰富;其中解木糖赖氨酸芽胞杆菌对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum等具有拮抗作用[28]，P. koreensis等具有促生作用[29]。

本研究分析了水稻田、山垅和林下3种种植模式下七叶一枝花土壤中根际和非根际芽胞杆菌资源多样性，为七叶一枝花不同生境的栽培提供良好的理论基础。

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（责任编辑：黄爱萍）