基于转录组测序技术的黄唇鱼SSR分子标记筛选

赵彦花 区又君 温久福 李加儿 周慧

摘要：【目的】筛选出可用于黄唇鱼（Bahaba flavolabiata）遗传资源评价及亲缘鉴定的SSR分子标记，为开展其保护遗传学研究打下基础。【方法】利用Illumina HiSeq 4000测序平台对野生黄唇鱼样本进行转录组测序，采用TGICL对转录组数据进行聚類去冗余以获得Unigene，并通过生物信息学方法进行功能注释分类、代谢通路和SSR特征分析等。【结果】黄唇鱼混合组织的转录组测序共获得13.43 Gb数据，经组装并去冗余后获得65047条Unigenes。采用BLAST对组装获得的Unigenes进行七大功能数据库（NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro）注释，结果共有55583条Unigenes被注释（占85.45%）。通过MISA对黄唇鱼的Unigene进行SSR搜索，共检测到29797个SSR位点分布于19664条Unigenes中。SSR位点分布类型及其特征分析结果显示，最主要的重复类型为二核苷酸重复基元（11855个，占39.79%），其次是单核苷酸重复基元（9695个，占32.54%）和三核苷酸重复基元（6663个，22.36%），而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元的数量相对较少。二核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AC/GT（8355条），在三核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AGG/CCT（1866条）。从随机选取的186对SSR引物中，最终筛选出47对扩增稳定性好且具有多态性的SSR引物，以二核苷酸和四核苷酸重复基元的扩增结果居多。【结论】通过转录组测序能有效筛选出具有多样性的黄唇鱼SSR分子标记，可为黄唇鱼的遗传多样性分析、亲缘鉴定和遗传图谱构建等后续研究提供基础资料。

关键词： 黄唇鱼;SSR分子标记;转录组测序;功能注释;多态性

中图分类号： S965.299                                  文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）09-2078-10

Abstract：【Objective】SSR markers， which could be used to evaluate genetic resources and identify genetic relatives of Bahaba flavolabiata， were selected to lay a foundation for the study of conservation genetics. 【Method】Illumina HiSeq 4000 sequencing platform was used to carry out transcriptome sequencing on wild B. flavolabiata. TGICL was used to cluster and remove redundancy from transcriptome data to obtain Unigene. Functional annotation classification， metabolic pathway and SSR characteristics were analyzed by bioinformatics. 【Result】Transcriptome sequencing of mixed tissues of B. flavolabiata obtained a total of 13.43 Gb data， and 65047 Unigenes were obtained after assembly and redundancy removal. Unigenes generated by BLAST were annotated in seven functional databases（NR， NT， GO， COG， KEGG， Swissprot and Interpro）， and a total of 55583 Unigenes were annotated（accounting for 85.45%）. Through SSR search on Unigenes of B. flavolabiata by MISA， a total of 29797 SSRs were detected distributed in 19664 Unigenes. SSR loci distribution type and its characteristic analysis results showed that， the major repeat types were dinucleotide repeat units （11855， accounting for 39.79%）， followed by single nucleotide repeat units（9695， accounting for 32.54%） and trinucleo-tide repeat units（6663， accounting for 22.36%）， while the number of tetrapotide， pentapotide and hexapotide repeat units was relatively small. The most repeated motif in dinucleotide repeats was AC/GT（8355）， while the most repeated motif in dinucleotide repeats was AGG/CCT（1866）. From the 186 pairs of SSR primers randomly selected， 47 pairs of SSR pri-mers with good amplification stability and polymorphism were finally selected， and the amplification results of dinucleotide and tetrauleotide repeat primitives were the majority. 【Conclusion】SSR molecular markers with diversity can be effectively screened out by transcriptome sequencing， which can provide basic data for the genetic diversity analysis， genetic identification and genetic mapping construction of B. flavolabiata.

Key words： Bahaba flavolabiata; SSR makers; transcriptome sequencing; functional annotation; polymorphism

0 引言

【研究意義】微卫星（Microsatellite）广泛分布于真核生物基因组中，是由1～6个核苷酸单位组成的简单串联重复序列，因此又称为简单序列重复（Simple sequence repeats，SSR）。SSR广泛分布于基因组的不同位置，其高度多态性主要来源于串联数目的不同（熊良伟等，2018）。SSR分子标记具有分布数量丰富、多态性高、共显遗传、扩增稳定和易检测等优点（王忠华等，2008），在种质遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建及分子标记辅助育种等领域已得到广泛应用（赵志英等，2018），且逐渐发展成为经济鱼类遗传结构分析、亲缘关系鉴定及遗传图谱构建等方面的有效工具（孙效文等，2008;谢子强等，2013;何福玲等，2017），但SSR分子标记具有种质特异性，因此使用前必须提前进行筛选开发。【前人研究进展】目前，开发SSR分子标记最常用的方法主要有：①从公共数据库中查找SSR位点;②近缘物种间引物转移扩增;③从基因组DNA中筛选SSR位点（王玲玲等，2017）。第①种方法经济方便，但局限于已开发出SSR位点的物种，且引物数量不会增加。第②种方法在不同物种间共用SSR引物时，其盲目性较大，具有一定的风险性和局限性。对于无法从前两种方法获得SSR引物的物种，可从基因组DNA中筛选SSR位点，但需经建库、杂交、分离及测序等步骤，工作量大、效率低。采用传统磁珠富集法开发SSR分子标记效率低且成本高（Zane et al.，2002），而利用高通量测序技术开发SSR分子标记能极大提高开发效率，并有效降低成本。转录组测序技术可快速获得生物体内较全面的转录本信息，尤其对于缺乏基因组信息的鱼类，转录组测序技术是获得大量分子标记的有效手段（王明等，2015）。近年来，随着转录组测序技术的快速发展，通过高通量测序技术测定转录组cDNA序列揭示特定细胞或组织中表达的全部基因已在许多物种上得到广泛应用，并开发出大量基于转录组的分子标记，如夏威夷石斑鱼（Epinephelusquernus）（Rivera et al.，2003）、金枪鱼（Thunnus thunnus）（Clark et al.，2004）、红鳍东方鲀（Fugu rubripes）（Furukawa et al.，2004）、大西洋鲑 （Salmo salar）（King et al.，2005）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（Pardo et al.，2005）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）（孙成飞等，2015）、二长棘鲷（Parargyrops edita）（杨兵等，2015）和黄姑鱼（Nibea albiflora）（龚诗琦等，2016）等。【本研究切入点】黄唇鱼（Bahaba flavolabiata）是我国特有种，俗称金钱鮸、金钱鳘、大鸥和白花等，隶属于硬骨鱼纲鲈形目石首鱼科黄唇鱼属（区又君等，2010，2011，2012，2013，2014），一直被视为上等补品，尤其是其鳔（俗称鱼胶）甚为珍贵，具有滋补肝肾之功效。由于生态环境恶化和过度捕捞等原因，导致黄唇鱼自然资源急剧下降，于1988年被列为国家二级重点保护野生动物，2006年被世界自然保护联盟（IUCN）红色名录列为极度濒危物种，因而制约了黄唇鱼生物学研究的开展。目前，基于SSR分子标记的黄唇鱼遗传多样性分析鲜见报道。【拟解决的关键问题】利用Illumina HiSeq 4000测序平台对野生黄唇鱼样本进行转录组测序，采用TGICL对转录组数据进行聚类去冗余以获得Unigene，并通过生物信息学方法进行功能注释分类、代谢通路和SSR特征分析等，旨在筛选出可用于黄唇鱼遗传资源评价及亲缘鉴定的SSR分子标记，为开展其保护遗传学研究打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

转录组测序样本为珠江口海域误捕的黄唇鱼，共1尾。用于多态性引物筛选的样本来自同一海域的野生黄唇鱼，共6尾，剪取其鳍条后酒精保存备用。

1. 2 黄唇鱼转录组测序

委托深圳华大基因科技有限公司进行黄唇鱼各组织总RNA提取，采用Illumina HiSeq 4000进行测序，获得黄唇鱼转录组的原始序列。原始序列经数据过滤后得到高质量的Clean reads，以Trinity对Clean reads进行组装，然后采用TGICL对转录本进行聚类去冗余以获得Unigene。利用MISA对Unigene的SSR位点进行检测，单核苷酸重复大于12次、二核苷酸重复大于6次、三核苷酸和四核苷酸重复大于5次、五核苷酸和六核苷酸重复次数大于4次的判断为SSR位点。

1. 3 基因组DNA提取与检测

取6尾黄唇鱼样本尾鳍各30.0 mg左右，使用海洋动物组织基因组DNA试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取基因组DNA。取6.0 μL左右的DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用NanoDrop ND-1000紫外分光光度仪检测其浓度和质量;获得的DNA用双蒸水稀释成100 ng/μL工作液，-20 ℃保存备用。

1. 4 SSR引物设计与验证

1. 4. 1 SSR引物设计 使用Primer Premier 3.0对含SSR位点的Unigenes进行引物设计，共设计出26949对引物。引物设计原则：GC含量为40%～60%，引物长度为18～23 bp，退火温度为55～65 ℃，目的片段长度为80～200 bp。从上述引物中随机选取186对引物，委托广州擎科生物技术有限公司进行引物合成，筛选条件：二核苷酸重复基元在8次以上，三核苷酸和四核苷酸重复基元在5次以上，五核苷酸和六核苷酸重复基元在4次以上。

1. 4. 2 PCR扩增 在Eppendorf普通梯度PCR仪中进行PCR扩增，反应体系10.0 μL，包括100 ng/μL基因组DNA 1.0 μL，2×PCR Mix 5.0 μL，正、反向引物各0.4 μL，超纯水3.2 μL。擴增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，55～65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。最终确定各引物最适退火温度为58 ℃，PCR产物以3%琼脂糖凝胶电泳进行检测，筛选出121对可扩增出目的片段的SSR引物。

1. 4. 3 SSR引物多态性检测 将121对SSR引物扩增的PCR产物送至广州擎科生物技术有限公司进行测序和多态性检测。测序采用ABI 3730XL仪器检测得到测序峰图，然后以Chromas查看峰图，找到出现多态性的引物扩增结果，确定具有多态性的引物。多态性测序结果的判断方法：查看峰图找到重复序列位置，确认出现套峰的位置是否位于重复序列区间。另外，结合两个终止峰（A碱基）位置判断重复数的差异数量，从而确定引物的扩增结果是否存在多态性。

2 结果与分析

2. 1 黄唇鱼转录组测序结果

黄唇鱼混合组织的转录组测序共获得13.43 Gb数据，经组装并去冗余后获得65047条Unigenes，其总长度为69382127 bp、平均长度为1066 bp，N50（按Unigene长度从大到小排序后逐个累加至所有Unigenes总长度的50%时，最后一个累加的数值即为N50，用于衡量组装的连续性，数值越大说明组装效果越好）为2032 bp，GC含量为46.65%。Unigene长度分布情况如图1所示，其中，最小片段长度为300 bp，数量最多，有17704条;片段长度大于3000 bp的Unigenes有5013条。

2. 2 Unigene功能注释结果

采用BLAST对组装获得的Unigenes进行七大功能数据库（NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro）注释，注释结果详见表1。其中，38086条Unigenes注释到NR数据库（58.55%），54929条Unigenes注释到NT数据库（84.45%），32384条Unigenes注释到Swissprot数据库（49.79%），12572条Unigenes注释到COG数据库（19.33%），31228条Unigenes注释到KEGG数据库（48.01%），3099条Unigenes注释到GO数据库（4.76%），28318条Unigenes注释到Interpro数据库（43.53%）。NR数据库属于非冗余蛋白序列数据库，其数据来源于GenPept、Swissprot、PIR、PDF、PDB和NCBI RefSeq。根据NR注释结果统计注释基因的物种分布情况，结果（图2）显示，80.68%黄唇鱼Unigenes能匹配到大黄鱼（Larimichthys crocea）的相应蛋白中，表明在所比对的鱼类中，黄唇鱼与大黄鱼的同源性最高，二者亲缘关系最近;其次为深裂眶锯雀鲷（Stegastes partitus）（2.98%）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）（1.21%）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）（1.18%）;匹配到其他物种上的Unigege比例为13.95%。

2. 3 Unigene功能分类结果

2. 3. 1 COG分类 COG是直系同源家族蛋白数据库，通过COG数据库比对可进行功能注释、归类及蛋白进化分析。黄唇鱼转录组中被COG功能注释的Unigenes共12572条，而这些Unigenes又被分成25个类别（图3）。其中，与功能预测类相关的Unigene数量最多（4680条，占37.23%）;其次是与转录（2015条，占16.03%），复制、重组和修复（1988条，占15.81%），翻译、核糖体结构和生物合成（1821条，占14.48%），信号传导机制（1468条，占11.68%），翻译后修饰、蛋白折叠和分子伴侣（1296条，10.31%）等基因工程类相关的Unigene;与细胞运动类序列细胞周期调控、细胞分裂和染色体分区（1515条，12.05%）及代谢类序列碳水化合物转运和代谢（1419条，11.29%）相关的Unigene数量也较多;而与核结构相关的Unigene数量最少，仅有6条。

2. 3. 2 GO分类 GO是一个国际标准的基因功能分类体系，利用GO数据库进行比对分析可将Unigenes分为生物工程、细胞组分和分子功能三大功能类别。由图4可看出，生物工程过程可细分为25类，其中与细胞进程相关的Unigene数量最多（1804条），其次是与单细胞生物进程相关的Unigene（1535条），与细胞杀伤相关的Unigene数量最少（1条）;细胞组分可细分为18类，其中与细胞（1291条）、细胞部分（1271条）和细胞膜（1046条）相关的Unigene数量较多，而与细胞外基质组分（1条）、病毒颗粒（4条）和病毒颗粒部分（4条）相关的Unigene数量最少;分子功能可细分为14类，其中与结合相关的Unigene数量最多（1628条），其次是与催化活性相关的Unigene（1020条），与化学排斥物活性和蛋白标签相关的Unigene数量最少，均为1条。

2. 3. 3 KEGG分类 KEGG是处理基因组、生物通路、疾病、药物和化学物质间联系的集成数据库。本研究根据功能不同，将KEGG数据库划分为细胞过程、环境信息处理、基因信息处理、人类疾病、新陈代谢和生物系统六大通径，并细分为44类（图5）。通过KEGG数据库比对分析，得到注释的Unigene共31228条。其中，与信号分子和相互作用相关的Unigene数量最多（5843条），其次是与癌症在视图相关的Unigene，有3288条，而与生物合成和次生代谢物相关的Unigene数量最少，仅19条。

2. 4 SSR特征分析结果

通过MISA对黄唇鱼的Unigene进行SSR搜索，共检测到29797个SSR位点分布于19664条Unigenes中。其中，最主要的重复类型为二核苷酸重复基元（11855个，占39.79%），其次是單核苷酸重复基元（9695个，占32.54%）和三核苷酸重复基元（6663个，22.36%），而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元的数量相对较少（图6）。二核苷酸和三核苷酸重复基元种类较丰富，分别有4和10种。在二核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AC/GT（8355条），在三核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AGG/CCT（1866条）。在6种核苷酸重复基元分布中，单核苷酸重复基元次数分布在12～132次，二核苷酸重复基元次数分布在6～74次，三核苷酸重复基元次数分布在5～49次，四核苷酸重复基元次数分布在5～33次，五核苷酸重复基元次数分布在4～13次，六核苷酸重复基元次数分布在4～12次，其中在6种核苷酸重复基元类型中均可见的重复次数为12次，而重复次数最多的为6次。

2. 5 SSR引物有效性验证和多态性检测结果

在SSR引物预扩增试验中，以合成的186对SSR引物对6尾黄唇鱼基因组DNA进行扩增，PCR产物以3.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果筛选出121对能扩增出目的条带的SSR引物，扩增成功率达65.05%。将121对SSR引物的PCR扩增产物送至广州擎科生物技术有限公司进行测序和多态性检测，经比对分析最终筛选出47对扩增稳定性好且具有多态性的SSR引物（表2），多态性比例为38.84%，其中以二核苷酸和四核苷酸重复基元的扩增结果居多。

3 讨论

黄唇鱼是我国特有种，但近年来因环境污染及过度捕捞等原因，导致其资源量急剧下降，因此，亟需开展黄唇鱼保护遗传学的相关研究。本研究利用高通量测序技术对黄唇鱼转录组遗传资源进行挖掘，共获得13.43 Gb数据，经组装并去冗余后得到65047条Unigenes，其总长度为69382127 bp，平均长度为1066 bp，N50为2032 bp，GC含量为46.65%，表明黄唇鱼转录组数据具有较高质量，可为开展黄唇鱼保护遗传学研究提供支撑。在黄唇鱼基因组信息缺乏的情况下，利用BLAST对组装获得的Unigenes进行七大功能数据库（NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro）注释，共有55583条Unigenes被注释（占85.45%），通过Unigene注释可为黄唇鱼功能基因的发掘提供参考序列。尤其是通过GO、COG和KEGG功能分类及代谢通路等分析，不仅可为黄唇鱼相关基因克隆及功能分析等提供基础数据，还能为其保护遗传学研究提供大量可利用的基因资源。

转录组测序是开发SSR分子标记的一种有效方法，目前已从橄榄蚌（Solenaia oleivor）（徐艳，2014）、施氏鲟（Acipenser schrenckii）（孔杰等，2015）、翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）（袁文成，2015）、安吉小鲵（Hynobius amjiensis）（王宇等，2017）和中华蜜蜂（Apiscerana cerana）（熊翠玲等，2017）的转录组成功开发出大量SSR分子标记。本研究通过对黄唇鱼进行转录组测序，检测到29797个SSR位点分布于19664条Unigenes中。黄唇鱼高通量测序结果显示这些SSR位点类型呈多样性，包含单核苷酸～六核苷酸重复基元，且不同重复类型的数量差异明显，其中，最多的重复类型为二核苷酸重复基元，其次是单核苷酸和三核苷酸重复基元。在二核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AC/GT，占二核苷酸重复基元的70.48%，与在团头鲂（Megalobrama amblycephala）（曾聪等，2013）和翘嘴鳜（S. chuatsi）（袁文成，2015）上的研究结果相同，但与许多植物以单核苷酸重复基元为主的结论不同，说明不同物种的碱基重复基序存在种属差异。

本研究从随机挑选的186对SSR引物中筛选出121对能扩增出目的条带的SSR引物，扩增成功率达65.05%。进一步进行测序分析和多态性检测，结果筛选出47对扩增稳定性好且具有多态性的SSR引物，多态性比例为38.84%。本研究中黄唇鱼SSR多态性引物扩增效率不高的原因可能是：（1）随机筛选的SSR引物存在不均性;（2）某些序列拼接错误或引物设计质量不高;（3）用于多态性验证的黄唇鱼样本数量较少导致群体等位基因数和遗传多样性相应较低，但具体原因有待进一步探究。

4 结论

通过转录组测序能有效筛选出具有多样性的黄唇鱼SSR分子标记，可为黄唇鱼遗传多样性分析、亲缘鉴定和遗传图谱构建等后续研究提供基础资料。

参考文献：

龚诗琦，王志勇，肖世俊，林爱强，谢仰杰. 2016. 黄姑鱼转录组SSR的开发与验证[J]. 集美大学学报（自然科学版），21（4）：241-246. [Gong S Q，Wang Z Y，Xiao S J，Lin A Q，Xie Y J. 2016. Development and verification of SSR based on transcription of yellow drum，Nibea albiflora[J]. Journal of Jimei University（Natural Science），21（4）：241-246.]

何福玲，凌正宝，肖俊，郭忠宝，钟欢，杨弘，陈文治，唐瞻杨，单丹，梁军能，甘西，罗永巨. 2017. 两个人工选择奥利亚罗非鱼群体系统发育及其遗传多样性分析[J]. 南方农业学报，48（2）：341-349. [He F L，Ling Z B，Xiao J，Guo Z B，Zhong H，Yang H，Chen W Z，Tang Z Y，Shan D，Liang J N，Gan X，Luo Y J. 2017. Phylogeny and genetic diversity of two artificial selection Oreochromis aureus populations[J]. Journal of Southern Agriculture，48（2）：341-349.]

孔杰，石婧，向燕，关梅. 2015. 基于微卫星标记的养殖施氏鲟亲鱼群体遗传多样性[J]. 贵州农业科学，43（12）：119-122. [Kong J，Shi J，Xiang Y，Guan M. 2015. Genetic diversity of Acipenser schrenckii from hatchery with microsatellite to genetic markers[J]. Guizhou Agricultural Scien-ces，43（12）：119-122.]

区又君，廖锐，李加儿，勾效伟. 2010. 野生黄唇鱼Bahaba flavolabiata肌肉和鳔营养成分的分析与评价[J]. 海洋学报，32（3）：113-120. [Ou Y J，Liao R，Li J E，Gou X W. 2010. The analysis and evaluation of nutrition composition in muscle and air bladder of wild Bahaba flavolabiata[J]. Acta Oceanologica Sinica，32（3）：114-119.]

区又君，廖锐，李加儿，勾效伟. 2011. 黄唇鱼的耳石形态和微结构特征[J]. 广东农业科学，38（12）：123-124. [Ou Y J，Liao R，Li J E，Gou X W. 2011. The morphology of otolith and its characteristics of microstructure in Bahaba flavolabiata[J]. Guangdong Agricultural Science，38（12）：123-124.]

区又君，廖锐，李加儿，勾效伟. 2013. 黄唇鱼矢耳石的生长特性及与鱼体生长的关系[J]. 江苏农业科学，41（6）：189-192. [Ou Y J，Liao R，Li J E，Gou X W. 2013. The growth characteristics of sagittal otolith of Bahaba flavolabiata and its relationship with the growth of fish body[J]. Jiangsu Agricultural Science，41（6）：189-192.]

区又君，廖锐，李加儿，勾效伟. 2014. 采用耳石日轮研究珠江口黄唇鱼幼鱼的产卵期及生长[J]. 生态科學，33（2）：209-212. [Ou Y J，Liao R，Li J E，Gou X W. 2014. Stu-dies on the spawning period and growth of young Bahaba flavolabiata in estuary of Pearl River by otolith determination[J]. Ecological Science，33（2）：209-212.]

区又君，廖锐，李加儿，李刘冬，勾效伟. 2012. 4种石首鱼耳石形态特征的比较[J]. 华南农业大学学报，33（2）：203-210. [Ou Y J，Liao R，Li J E，Li L D，Gou X W. 2012. Comparison of morphological characteristics of otolith in four Sciaenid fishes[J]. Journal of South China Agricultural University，33（2）：203-210.]

孙成飞，叶星，董浚键，田园园，梁健辉. 2015. 罗氏沼虾6个养殖群体遗传多样性的微卫星分析[J]. 南方水产科学，11（2）：20-26. [Sun C F，Ye X，Dong J J，Tian Y Y，Liang J H. 2015. Genetic diversity analysis of six cultured populations of Macrobrachium rosenbergii using microsatellite markers[J]. South China Fisheries Science，11（2）：20-26.]

孙效文，张晓锋，赵莹莹，张研，贾智英，常玉梅，鲁翠云，梁利群. 2008. 水产生物微卫星标记技术研究进展及其应用[J]. 中国水产科学，15（4）：689-703. [Sun X W，Zhang X F，Zhao Y Y，Zhang Y，Jia Z Y，Chang Y M，Lu C Y，Liang L Q. 2008. Development and application of microsatellite markers in aquatic species[J]. Journal of Fishery Sciences of China，15（4）：689-703.]

王玲玲，陈东亮，黄丛林，邢震. 2017. SSR分子标记技术在植物研究中的应用[J]. 安徽农业科学，45（36）：123-126. [Wang L L，Chen D L，Huang C L，Xing Z. 2017. Application of SSR molecular marker technique in plant research[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，45（36）：123-126.]

王明，应东山，王琴飞，李莉萍，黄建锋，张如莲. 2015. 基于454 GSFLX高通量测序的芒果微卫星标记特征分析[J]. 南方农业学报，46（10）：1745-1749. [Wang M，Ying D S，Wang Q F，Li L P，Huang J F，Zhang R L. 2015. Deve-lopment and characteristics analysis of microsatellite mar-ker in mango（Mangifera indica L.） by using 454 GSFLX high-throughput sequencing[J]. Journal of Southern Agriculture，46（10）：1745-1749.]

王宇，李丹丹，邵晨. 2017. 安吉小鲵微卫星标记及其应用：CN106868186A[P]. 2017-06-20. [Wang Y，Li D D，Shao C. 2017. Microsatellite marker of Hynobius amjiensis and its application：CN106868186A[P]. 2017-06-20.]

王忠华，董西征，钱国英. 2008. DNA分子标记技术在水生动物遗传多样性研究中的应用[J]. 科技通报，24（5）：623-630. [Wang Z H，Dong X Z，Qian G Y. 2008. Application in genetic diversity of aquatic of DNA molecular markers[J]. Bulletin of Science and Technology，24（5）：623-630.]

谢子强，刘雪媚， 郭昱嵩，刘楚吾. 2013. 北部湾皮氏叫姑鱼的遗传多样性分析[J]. 南方农业学报，44（1）：140-144. [Xie Z Q，Liu X M，Guo Y S，Liu C W. 2013. Genetic diversity analysis of Beibu Gulf Johnius belengerii[J]. Journal of Southern Agriculture，44（1）：140-144.]

熊翠玲，张璐，付中民，王鸿权，侯志贤，童新宇，李汶东，郑燕珍，陈大福，郭睿. 2017. 基于RNA-seq数据大规模开发中华蜜蜂幼虫的SSR分子标记[J]. 环境昆虫学报，39（1）：68-74. [Xiong C L，Zhang L，Fu Z M，Wang H Q，Hou Z X，Tong X Y，Li W D，Zheng Y Z，Chen D F，Guo R. 2017. Large-scale development of SSR primers for Apis cerana cerana larvae based on its RNA-seq datasets[J]. Journal of Environmental Entomology，39（1）：68-74.]

熊良伟，王帅兵，岳丽佳，王建国，陶桂庆，徐亮，王权. 2018. 寬体金线蛭基因组SSR序列特征分析及其分子标记开发[J]. 南方农业学报，49（11）：2298-2303. [Xiong L W，Wang S B，Yue L J，Wang J G，Tao G Q，Xu L，Wang Q. 2018. SSR sequence characters for genome of Whitmania pigra Whitman and development of molecular markers[J]. Journal of Southern Agriculture，49（11）：2298-2303.]

徐艳. 2014. 橄榄蛏蚌微卫星标记开发及群体遗传多样性分析[D]. 武汉：华中农业大学. [Xu Y. 2014. Isolation of microsatellite markers and population genetic diversity analysis in Solenaia oleivora[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

杨兵，林琳，李纯厚，徐姗楠，刘永，肖雅元，陈作志. 2015. 基于高通量测序的二长棘鲷微卫星标记开发与评价[J]. 南方水产科学，11（4）：116-120. [Yang B，Lin L，Li C H，Xu S N，Liu Y，Xiao Y Y，Chen Z Z. 2015. Development and evaluation of microsatellite markers in Parargyrops edita[J]. South China Fisheries Science，11（4）：116-120.]

袁文成. 2015. 基于转录组测序的翘嘴鳜微卫星标记的开发及MHC classI基因的克隆表达[D]. 苏州：苏州大学. [Yuan W C. 2015. Development of SSR makers and MHC classI cloning and expressing of Siniperca chuatsi by RNA-Seq[D]. Suzhou：Soochow University.]

赵志英，梁丽运，白丽蓉. 2018. 斑节对虾3个野生群体遗传多样性的微卫星标记分析[J]. 热带海洋学报，37（3）：65-72. [Zhao Z Y，Liang L Y，Bai L R. 2018. Analysis of genetic diversity among three wild populations of Penaeus monodon using microsatellite marker[J]. Journal of Tro-pical Oceanography，37（3）：65-72.]

曾聪，高泽霞，罗伟，刘肖莲，王卫民. 2013. 基于454 GS FLX高通量测序的团头鲂ESTs中微卫星特征分析[J]. 水生生物学报，37（5）：982-988. [Zeng C，Gao Z X，Luo W，Liu X L，Wang W M. 2013. Characteristics of microsate-llites in blunt snout bream（Megalobrama amblycephala） EST sequence using 454 FLX[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，37（5）：982-988.]

Clark T B，Ma L，Saillant E，Gold J R. 2004. Microsatellite DNA markers for population-genetic studies of Atlantic bluefin tuna（Thunnus thynnus thynnus） and other species of genus Thunnus[J]. Molecular Ecology Notes，4（1）：70-73.

Furukawa S，Takeshima H，Otaka T，Mitsuboshi T，Shirasu K，Ikeda D，Kaneko G，Nishida M，Watabe S. 2004. Isolation of microsatellite markers by in silico screening implicated for genetic linkage mapping in Japanese pufferfish Takifugu rubripes[J]. Fisheries Science，70（4）：620-628.

King T L，Eackles M S，Letcher B H. 2005. Microsatellite DNA markers for the study of Atlantic salmon（Salmo salar） kinship，population structure，and mixed fishery ana-lyses[J]. Molecular Ecology Notes，5（1）：130-132.

Pardo G B，Casas L，Fortes G G，Bouza C，Martínez P，Clark M S，Sánchez L. 2005. New microsatellite markers in turbot（Scophthalmus maximus） derived from an enriched genomic library and sequence databases[J]. Molecular Eco-logy Notes，5（1）：62-64.

Rivera M A J，Graham G C，Roderick G K. 2003. Isolation and characterization of nine microsatellite loci from the Hawaiian grouper Epinephelus quernus（Serranidae） for po-pulation genetic analyses[J]. Marine Biotechnology，5（2）：126-129.

Zane L，Bargelloni L，Patarnello T. 2002. Strategies for microsatellite isolation：A review[J]. Molecular Ecology，11（1）：1-16.

（責任编辑 兰宗宝）