固定化酵母发酵制备辣木果酒的工艺研究

黄春秋 林君 麻少莹 黄卫萍 黄友琴 马腾飞

摘要：【目的】研究固定化酵母发酵制备辣木果酒的工艺条件，为辣木资源开发提供新途径。【方法】以高活性干酵母安琪171#为固定酵母载体，通过单因素试验探讨辣木液初始糖度、发酵温度、焦亚硫酸钠用量和发酵pH等因素对辣木果酒酒精度形成的影响，再通过正交试验确定辣木果酒的最佳发酵工艺条件。【结果】影响辣木果酒发酵工艺的因素排序为发酵温度>初始糖度>发酵pH>焦亚硫酸钠用量，发酵温度对辣木果酒酒精度有显著影响（P<0.05）。固定化酵母发酵制备辣木果酒的最佳工艺：初始糖度25%、发酵温度29 ℃、焦亚硫酸钠用量80 mg/L、发酵pH 4.5，在此条件下得到的果酒酒精度达11.6%（v/v）。【结论】利用固定化酵母发酵制得的辣木果酒色泽淡黄、清澈稳定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，风味独特，研究工艺参数经济可行，可为规模化生产提供数据基础。

关键词： 辣木果酒;固定化酵母;发酵;工艺优化

中图分类号： S792.99                                  文献标志码： A       文章编号：2095-1191（2019）09-2065-06

Abstract：【Objective】The processing conditions of using immobilized yeastto ferment Moringa oleifera fruit wine was studied to provide new ways for M. oleifera resource development.  【Method】The effects of initial sugar content， fermentation temperature， sodium pyrosulfite dosage and pH on the M. oleifera fermentation liquid were studied by single factor experiment with high active dry yeast Angel No.171 as the carrier of fixed yeast. The optimum fermentation conditions of M. oleifera fruit wine were determined by orthogonal experiment. 【Result】The factors affecting the fermentation process of M. oleifera fruit wine were as follows as fermentation temperature>initial sugar content>fermentation pH>sodium pyrosulfite dosage. Fermentation temperature had significant effects on M. oleifera fruit wine alcoholicity（P<0.05）. The results of the single factor experiment of immobilized yeast showed that the optimum initial sugar content， fermentation temperature， sodium pyrosulfite dosage and fermentation pH were 25%， 29 ℃， 80 mg/L and 4.5， respectively. Under such conditions， the obtained alcoholicity was 11.6%（v/v）. 【Conclusion】The obtained M. oleifera fruit wine produced by immobilized yeast fermentation has light yellow color， clear and stable color， elegant M. oleifera fragrance， mellow taste， unique flavor. The processing parameters are feasible， and also can provide data basis for large-scale production.

Key words：  Moringa oleifera; immobilized yeast; fermentation; processing optimization

0 引言

【研究意义】辣木（Moringa oleifera）又称奶牛树，为辣木科辣木属多年生热带落叶乔木，传统辣木生长在非洲东部及印度北部（王立等，2016）。辣木具有良好的功能活性，研究表明，辣木葉和辣木籽中含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质等多种营养成分，已广泛应用于食品生物、医药保健和净水处理等领域（Jahn，1996）;辣木叶粉比优良保健食品螺旋藻含有更高的蛋白质和总膳食纤维，且脂肪含量偏低，更符合现代人们的营养健康需求（刘昌芬和李国华，2004）;辣木叶中的植物黄酮、蛋白质和脂肪酸具有抗氧化活性和调节血糖功能，可作为重要的药用资源（赵欢等，2017）。2012年11月我国原卫生部批准辣木叶作为新资源食品，尽管国外有着悠久的食用历史（Anwar et al.，2007），但国内尚未被大众所熟识。目前市场上辣木产品较少，仅有辣木粉、辣木茶饮料等少数品种，未见辣木发酵酒、辣木醋等产品销售。因此，开展辣木发酵酒尤其是辣木果酒的研究，对于丰富辣木多元化产品和促进辣木产业深加工发展具有重要意义。【前人研究进展】目前，关于辣木叶贮藏及相关食品加工方面的研究已有一些报道。马春花等（2018）进行辣木鲜叶贮藏保鲜试验，结果表明，辣木鲜叶在贮藏期间蛋白质含量变化不明显，但维生素含量损失较大，贮藏保鲜的最佳温度为4 ℃，贮藏时间不超过7 d;陈玉芹等（2017）以辣木叶为原料制作辣木茶，测得辣木茶含有17种氨基酸，总量为434.90 mg/g，其中含有7种必需氨基酸，含量明显高于传统绿茶，可作为一种新型茶品进行开发;卢仰文等（2018）以脱脂乳粉为原料，辅以辣木粉和干酪粉制备酸凝辣木干酪，其最佳工艺参数为脱脂乳粉50 ℃复水，63 ℃下30 min杀菌，降温至26 ℃，加入柠檬汁稀释液B至pH 4.6，静置20 min，过滤排除乳清，加入0.2%辣木粉和1.0%干酪粉搓揉混匀后得到成品;王小敏等（2018）以辣木叶为原料，加入甘草、山楂和决明子，研发出一种复合固体饮料，具有通便功效。国内有关辣木果酒的研究报道较少，仅见于少量公开的发明专利。王宪波（2015）先把辣木叶洗净、阴干、粗碎，制成250～300目的超细粉，将辣木粉与酵母按50∶1～200∶1的比例掺匀，经固体糖化发酵得到辣木基料;焦家良等（2017）用辣木粉、葛根、牛蒡根和玉竹等原料中一种或几种混合，干燥、粉碎，过筛制得辣木粉，再经水温30 ℃浸泡，固液分离，然后加入酵母发酵制得辣木果酒;杨涛（2017）、祝泽英等（2017）将辣木梗、辣木根和高粱混合，经酒曲发酵，过滤即得新型白酒保健辣木果酒。【本研究切入点】发布的辣木酒专利中，多采用浸泡法制辣木露酒，或与酒曲发酵制白酒型辣木果酒，尚未见利用固定化酵母发酵辣木制酒的相关研究报道。【拟解决的关键问题】提取辣木叶基料有效成分，通过单因素试验和正交试验，探讨辣木液初始糖度、发酵温度、焦亚硫酸钠用量和pH等因素对辣木果酒残糖量和酒精度的影响，以期获得最佳发酵工艺，为辣木资源的开发提供新途径。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

新鲜辣木叶为印度改良种PKM1辣木，采自广西农业职业技术学院中草药园。主要试剂：白砂糖（纯度95%，南宁糖业股份有限公司）;高活性干酵母安琪171#（湖北安琪酵母股份有限公司）;海藻酸钠（食品级，25 kg/包，安徽中旭生物科技有限公司）;无水氯化钙（食品级，四川华源盛泰生物科技有限公司）;焦亚硫酸钠（食品级，25 kg/包，寿光市鼎昊经贸有限公司）;柠檬酸（食品级，山东柠檬生化有限公司）。主要仪器设备：C21-SK2105电磁炉（广东佛山美的空调设备有限公司）;30B-X型中草药专用粉碎机（常州市力度干燥设备有限公司）;pHSJ-3F型pH计（上海精密科学仪器有限公司）;WTY型手持旋光仪（泉州中友光学仪器有限公司）;DHG-9245A恒温箱干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）;HH-S数显恒温水浴锅（江苏省常州市金坛华特实验仪器有限公司）;AR153CN型分析天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司];实验室型立式杀菌锅DN400型（上海科劳机械设备有限公司）;酒精计（河北省武强县仪都玻璃仪器仪表厂）;NAI-ZLY-6L智能一体化蒸馏仪（上海那艾精密仪器有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 工艺流程 辣木叶（新鲜、无病虫）→清洗→烘干→粉碎→浸提→过滤取汁→杀菌（90 ℃，15 min）→冷却→糖酸调配→硫处理→加固定化酵母→发酵→调配→澄清过滤→杀菌→灌装→辣木果酒成品。

1. 2. 2 操作步骤

1. 2. 2. 1 辣木基液提取 新鲜辣木叶烘干（60 ℃，12 h）、粉碎，用水（料液比1∶6）于85～90 ℃下浸提25 min，60目过滤即得辣木基液。

1. 2. 2. 2 固定化酵母制备 取0.3%高活性干酵母安琪171#，加入3%蔗糖溶液中，于30 ℃下活化30～60 min，再与0.1%海藻酸钠溶液混合，加入4%氯化钙溶液于3～6 ℃低温下形成凝胶，然后用无菌水冲洗3次，置于3～6 ℃冰箱固化24 h即得固定化酵母。

1. 2. 2. 3 辣木发酵液制备 取辣木基液于90 ℃杀菌15 min，冷却调整糖度，按试验设计加入焦亚硫酸钠进行硫化抑菌处理。

1. 2. 2. 4 辣木果酒调配和杀菌 将发酵好的辣木基酒进行糖酸等风味调配，澄清过滤后于90～93 ℃高温杀菌，灌装密封。

1. 2. 3 单因素试验设计 各试样中加入100 mg/L焦亚硫酸钠和固定化酵母后进行酒精发酵，研究不同初始糖度、发酵温度、焦亚硫酸钠用量和发酵pH对辣木发酵液残糖量和酒精度的影响。设定初始糖度为20%、25%、30%、35%和40%;发酵温度为20、23、26、29和32 ℃;焦亚硫酸钠用量为60、80、100、120和140 mg/L（陈智理等，2010）;pH为3.0、3.5、4.0、4.5和5.0。

1. 2. 4 正交試验设计 依据单因素试验结果，以初始糖度、发酵温度、焦亚硫酸钠用量和发酵pH为考察因素进行4因素3水平正交试验，优化固定化酵母发酵制备辣木果酒的工艺条件，试验设计见表1。

1. 2. 5 测定方法 利用手持旋光仪测定残糖量，pH计测定pH;按照GB/T 15038—2006酒精计法测定酒精含量，按照GB/T 15038—2006电位滴定法测定总酸。

1. 3 统计分析

单因素试验数据采用Excel 2007进行处理，正交试验设计采用方差分析进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 初始糖度对固定化酵母发酵的影响 根据前期研究的酵母菌用量单因素试验结果，确定固定化酵母用量为0.3%，发酵温度为26 ℃，研究不同初始糖度对固定化酵母发酵辣木果酒的影响，结果如图1和图2所示。从图1可看出，随着发酵时间的延长，辣木果酒的残糖量明显下降;残糖量与初始糖度密切相关，初始糖度越大，残糖量也越高，是由于一定量酵母可利用的糖有限。因此，过高的初始糖度不利于辣木果酒彻底发酵，甚至会导致辣木果酒成品过甜而影响感官品质。由图2可知，在一定糖度范围内，随初始糖度的增加，辣木果酒酒精度也逐渐增加，但初始糖度过高会影响酵母细胞的生长和代谢，不利于辣木果酒彻底而持续稳定地发酵。当初始糖度为30%时，酒精度达最高值9.8%（v/v）;初始糖度超过30%后，酒精度呈下降趋势，其原因可能是高浓度糖的渗透压抑制了固定化酵母的活性和增殖（高兆建，2005）。因此，初始糖度以选择25%～30%为宜。

2. 1. 2 发酵温度对固定化酵母发酵的影响 酵母对环境温度较敏感，发酵温度直接影响固定化酵母的活性和酿造效果。固定化酵母在一定条件下发酵，不同发酵温度对辣木果酒发酵效果的影响见图3和图4。由图3可知，随着发酵温度升高，辣木果酒发酵速度越快、残糖量降低明显。由图4可知，不同发酵温度下辣木果酒的酒精度存在明显差异。酒精度随发酵温度的升高逐渐上升，发酵温度为26 ℃时酒精度达最高值9.8%（v/v），之后随发酵温度升高酒精度呈下降趋势，32 ℃时酒精度仅为7.2%（v/v），可能是温度升高时，固定化酵母的活性反而受到抑制。因此，发酵温度选择26 ℃左右较合适。

2. 1. 3 焦亚硫酸钠用量对固定化酵母发酵的影响

焦亚硫酸钠具有抑菌、抗氧化和澄清作用，常用于果酒发酵。但其用量须严格控制，用量过多时，既不符合食品卫生和安全要求，又影响果酒的发酵效率和风味品质。由图5和图6可知，随着焦亚硫酸钠用量增多，辣木果酒的残糖量逐渐下降，酒精度上升，当焦亚硫酸钠用量为100 mg/L时，辣木果酒酒精度达9.4%（v/v），之后用量越大酒精度反而降低。说明焦亚硫酸钠用量过大不利于酵母发酵，可能因为焦亚硫酸钠浓度过高反而抑制酵母活性，影响发酵效率。因此，辣木果酒发酵制备选择焦亚硫酸钠添加量以80～120 mg/L为宜。

2. 1. 4 发酵pH对固定化酵母发酵的影响 酸度（pH环境）不仅影响各种微生物的生长繁殖，还会影响酶活力。从图7可看出，随着pH增大，辣木果酒的残糖量逐渐降低，pH达5.0时，经6 d发酵残糖量可降至5.4%。从图8可看出，随着pH增大，辣木果酒酒精度逐渐升高，当pH为4.0时酒精度达最高值9.7%（v/v），之后pH增大酒精度反而降低。说明pH过低或过高均不利于酵母发酵，原因可能是pH过低或过高，环境的酸碱度均会抑制酵母活性，影响发酵效率。故辣木果酒发酵环境选择在pH 3.5～4.5为宜。

2. 2 正交试验结果

由表2可知，影响固定化酵母发酵辣木果酒的因素排序为B>A>D>C，即发酵温度影响最大，初始糖度和发酵pH次之，焦亚硫酸钠用量影响最小。最佳组合为A2B3C1D3，即固定化酵母发酵辣木果酒最佳工艺条件为初始糖度25%、发酵温度29 ℃、焦亚硫酸钠用量80 mg/L、发酵pH 4.5。

由表3可知，发酵温度对固定化酵母发酵辣木果酒的影响效果显著（P<0.05），初始糖度、焦亚硫酸钠用量和发酵pH的影响均未达显著水平（P>0.05）。

为验证正交试验结果，在最佳发酵条件下进行3次平行试验，辣木果酒酒精度分别为11.7%（v/v）、11.4%（v/v）和11.8%（v/v），平均值11.6%（v/v），高于正交试验中任一组合的结果，验证了正交试验结果的正确性和可重复性。

3 讨论

固定化酵母相对于游离酵母具有发酵力强、发酵稳定、能连续发酵的优点，已广泛应用于多种果酒的发酵生产。本研究所选用的酵母为前期试验筛选出的高活性干酵母安琪171#，该酵母作为固定化酵母发酵生产辣木果酒的研究鲜见报道。前期研究进行游离酵母与固定化酵母发酵的试验对比，结果表明除发酵初期因固定化酵母细胞被包埋而发酵较慢外，后期发酵速度、持续发酵稳定性和产酒率（即酒精度）均优于游离酵母，与武运等（2008）采用固定化酵母发酵蟠桃酒、余森艳等（2015）采用固定化酵母酿造脐橙果酒的研究结果一致。故本研究选用固定化酵母发酵制备辣木果酒，可较好地保证生产辣木发酵酒的经济效率、得酒率和果酒品质。

本研究采用单因素试验和正交试验考察初始糖度、发酵温度、焦亚硫酸钠用量和发酵pH对固定化酵母发酵生产辣木果酒酒精度的影响，结果表明，初始糖度25%、发酵温度29 ℃、焦亚硫酸钠用量80 mg/L和发酵pH 4.5为最佳发酵工艺条件，主要影响因素为发酵温度，制得的辣木果酒酒精度高达11.6%（v/v）。研究结果和各影响因子的变化趋势与陈智理等（2010）采用固定化酵母发酵制备香蕉菠萝复合果酒、潘嫣丽等（2011）采用固定化酵母发酵制备雪莲果—西番莲复合果酒的结果基本相同，如初始糖度基本在20%～25%，pH 4.0～5.0为宜，也是经6 d左右时间发酵结束，说明固定化酵母的整体发酵基本规律一致。本研究所用抑制杂菌试剂为焦亚硫酸钠，区别于亚硫酸氫钠，其还原性更强、不易氧化损失，而亚硫酸氢钠具有不愉快味，且易于氧化为硫酸盐而降低抑菌作用;最适发酵温度为29 ℃，略高于陈智理等（2010）、潘嫣丽等（2011）研究的20～25 ℃，可能是辣木基液不同于其他原料，若要提高固定化酵母的发酵活力，因此需稍高于其他果酒类的发酵温度。

与焦家良等（2017）发酵制得辣木果酒，杨涛（2017）、祝泽英等（2017）经酒曲发酵得到的白酒保健辣木果酒相比，本研究制得的酒体色泽淡黄、清澈稳定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，风味独特;同时工艺参数经济可行，可为规模化生产提供数据基础。本研究制备得到的辣木果酒的呈香呈味、功效成分及功能验证有待进一步研究。

4 结论

利用固定化酵母在最佳工艺条件下发酵制得的辣木果酒色泽淡黄、清澈稳定，具有淡雅的辣木清香，口感醇和，风味独特，研究工艺参数经济可行，可为规模化生产提供参考。

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（责任编辑 罗 丽）