EDTA对猪肉12-脂肪氧合酶构象及酶活力的影响

王晶晶 张新笑 卞欢 耿志明 李鹏鹏 王道营 徐为民

摘要：【目的】探究乙二胺四乙酸鈉（EDTA）对猪肉12-脂肪氧合酶（12-LOX）构象和酶活力的影响，为猪肉加工贮藏过程中控制12-LOX活性提供参考依据。【方法】采用EDTA处理猪肉12-LOX，测定其酶活力，并分析EDTA对猪肉12-LOX的储藏稳定性、热稳定性、催化亚油酸反应、荧光光谱和圆二色谱（Circular dichrosim spectra，CD）的影响。【结果】添加EDTA可抑制猪肉12-LOX的酶活力，随EDTA浓度的增加，抑制作用逐渐增强，当EDTA浓度为10.0 mmol/L时，猪肉12-LOX活力约下降60%。EDTA能提高猪肉12-LOX的热稳定性和贮藏稳定性，使其比正常条件下保持较高酶活力。随着EDTA浓度的增加，猪肉12-LOX分子内部的α-螺旋和β-折叠含量降低，引起其二级结构发生明显变化;猪肉12-LOX的荧光强度不断减弱，EDTA浓度为20.0 mmol/L时，酶的内源荧光发射峰强度下降13%，但最大发射峰（λmax）的位置未发生变化。【结论】EDTA能引起猪肉12-LOX的构象变化进而抑制其酶活力。

关键词： 猪肉;12-脂肪氧合酶（12-LOX）;乙二胺四乙酸钠（EDTA）;活力;构象

中图分类号： S879.2;TS251                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）09-2052-06

Abstract：【Objective】To investigate the effects of sodium ethylene diamite tetracetate（EDTA） on the conformation and enzyme activity of porcine 12-lipoxygenase（12-LOX）， and provide reference for controlling 12-LOX activity during pork processing and storage. 【Method】Porcine 12-LOX was treated with EDTA to determine the enzyme activity of porcine 12-LOX， and the storage stability， thermal stability， catalytic linoleic acid reaction， fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectra（CD） of EDTA effects on porcine 12-LOX were analyzed. 【Result】The results showed that EDTA inhibited the activity of porcine 12-LOX and the inhibitory effect increased with the increasing of EDTA concentration. When the concentration of EDTA was 10.0 mmol/L， the activity of porcine 12-LOX decreased by 60% approximately. The addition of EDTA could increase the thermal stability and storage  stability of porcine 12-LOX and make porcine 12-LOX retain enzyme activity for a longer time than normal conditions. As the concentration of EDTA increased， the content of α-helix and β-sheet inside the porcine 12-LOX molecule decreased， causing obvious change in its secon-dary structure and the fluorescence intensity of porcine 12-LOX was continuously weakened. When the concentration of EDTA was 20.0 mmol/L， the intensity of the endogenous fluorescence emission peak of the enzyme decreased by 13%， but the position of the maximum emission peak（λmax） did not change. 【Conclusion】Collectively， this study indicates that EDTA can cause conformational change of porcine 12-LOX and result in the activity change of porcine 12-LOX， which may providereference for the control of LOX activity during meat processing and storage.

Key words： porcine; 12-lipoxygenase（12-LOX）; sodium ethylene diamite tetracetate（EDTA）; activity; conformation

0 引言

【研究意义】肉制品在加工过程中易发生脂质氧化，影响肉制品风味。脂类物质的氧化分为自动氧化和酶促氧化（张迎阳，2014），脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX）是酶促氧化最主要的内源酶，其专一性作用于多不饱和脂肪酸（PUFA）的顺，顺-1，4-戊二烯基位置，通过分子内加氧，生成具有共轭双键的氢过氧化物。氢过氧化物极不稳定，进一步反应生成多种挥发性化合物，这些物质一方面形成食品的主要风味物质（郇延军，2005;Roldan et al.，2014）;另一方面，食品中脂質的过度氧化产生刺激性气味物质，不仅引起食品风味劣变，还造成PUFA含量下降，导致食品营养品质降低，增加储藏难度（曹锦轩等，2015;Mashima and Okuyama，2015;Stephany et al.，2015;吴宝森等，2017;Navicha et al.，2017）。因此，研究乙二胺四乙酸钠（EDTA）对猪肉中LOX活性的影响，以期在实际应用中控制酶活力，从而使肉制品呈现良好风味。【前人研究进展】Gata等（1996）从猪的股二头肌中分离得到一种LOX，研究发现其可能参与伊比利亚火腿的风味形成。Fu等（2009，2015）研究发现，白鲢鱼体内的LOX能快速催化降解不饱和脂肪酸，产生与腥味相关的各种醛类物质，从而导致白鲢鱼在贮藏和加工过程中出现腥味增强问题。Jin等（2011）的研究结果表明，LOX在干腌培根加工过程中的脂肪氧化起重要作用，酸度、温度和盐含量是影响LOX活性的主要因素。因此，LOX的催化活性和影响因素成为肉品加工的研究热点。LOX属于氧化还原酶（闫静芳等，2013），广泛存在于动植物界中，是一种含非血红素铁的双加氧酶，其金属辅基的活化态为氧化性三价铁离子，非活化态为二价铁离子。猪肉12-LOX分子量约62 kDa，其X-射线衍射结果显示猪肉12-LOX包括2个结构域，即氨基端的PLAT结构域和羧基端的催化结构域（汪晓鸣，2014;张爽，2014）。外源物质引入会导致LOX的构象变化从而影响其催化行为。Cai等（2004）研究表明，外源铁离子以电子传递方式与大豆LOX活性中心铁发生作用，促进酶促反应进程。蔡燕（2011）、蔡燕等（2015）的研究结果表明，外源铜离子和钡离子均能与大豆LOX活性中心铁离子发生交换作用，从而抑制催化氧化豆油的反应。因此，在肉品加工和贮藏过程中控制和添加某些无机盐、有机电解质等物质可调控肉制品LOX活性，从而控制肉品风味。【本研究切入点】EDTA是一种金属离子螯合剂，能与12-LOX活性中心的铁离子结合，从而影响12-LOX活力。但目前未见有关EDTA对猪肉LOX活性影响的研究报道。【拟解决的关键问题】将EDTA加入到猪肉12-LOX的催化反应体系中，观察外源EDTA对猪肉12-LOX的催化活性、圆二色谱（Circular dichrosim spectra，CD）和荧光光谱的影响，研究EDTA与猪猪肉12-LOX的相互作用，为猪肉加工贮藏过程中控制12-LOX活性提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

猪肉12-LOX为前期课题组制备，亚油酸购自Sigma公司，盐酸、柠檬酸、柠檬酸三钠、EDTA、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等均为国产分析纯，购自生物工程（南京）股份有限公司。主要设备仪器：BioTek-Synergy2多功能酶标仪（美国BioTek公司）、M124A分析天平（意大利BEL公司）、HH-1数显恒温水浴锅（普析通用，常州国华电器有限公司）、MOS-450圆二色谱仪（法国Biologic公司）、LS-55 Fluorescence Spectrometer（美国PerkinElmer公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 酶活力测定

1. 2. 1. 1 底物溶液配制 将0.5 mmoL亚油酸溶于5 mL脱氧重蒸水（含180 μL Tween-20）中，使其充分混匀;逐滴加入1 mol/L氢氧化钠充分混匀直至体系清澈透明，再用1 mol/L盐酸调pH至9.0，直至亚油酸完全溶解，最后用脱氧重蒸水定容至50 mL。准备数支4 mL EP管，将该亚油酸储备液分装保存在EP管中，于-20 ℃下储存备用（何立超等，2016）。

1. 2. 1. 2 猪肉12-LOX活力测定 猪肉12-LOX活力测定方法在Kermasha和Metche（1986）的基础上有所改进。将20 μL亚油酸底物储备液与160 μL 50 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH 5.5）充分混匀，再加入20 μL酶液迅速混匀，于234 nm处测定其1 min内吸光值的增加量。以不加酶液（20 μL亚油酸底物与180 μL柠檬酸缓冲液）为空白。LOX活力定义（Szymanowska et al.，2009）：在一定温度和pH条件下，反应体系在234 nm波长处吸光值每分钟增加0.001表示为1个酶活力单位（U）。

1. 2. 2 EDTA对猪肉12-LOX活力的影响 按照酶活力测定方法，在反应总体系中加入EDTA溶液，使其终浓度分别为0（空白对照）、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0 mmol/L，测定其酶活力，以酶活力最高值为100%，即纵坐标为相对酶活力。

1. 2. 3 EDTA对猪肉12-LOX储藏稳定性的影响 猪肉12-LOX酶液在4 ℃下储藏7 d，分别测定0～7 d的酶活力;另外，在猪肉12-LOX酶液中加入EDTA，相同条件下测定酶活力，以酶活力最高值为100%。

1. 2. 4 EDTA对猪肉12-LOX热稳定性的影响 取100 μL猪肉12-LOX酶液在50 ℃水浴中分别水浴0、1、2、3、4、6和8 min，取出后置于冰上，测酶活力，以0 min的酶活力为100%;在酶液中加入EDTA后，按照上述方法测定酶活力。

1. 2. 5 EDTA对猪肉12-LOX催化亚油酸反应的影响 在酶活反应体系中，加入20 μL EDTA，测定30 min内酶活力的变化。以未加入EDTA的酶活力反应体系为对照。

1. 2. 6 EDTA对猪肉12-LOX CD光谱的影响 CD光谱能有效分析蛋白质二级结构的变化，常用于蛋白质二级结构测定（Kouassi et al.，2007）。以50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.6）为空白对照，CD光谱的扫描波长范围为200～250 nm，光源为氙灯，液池光径1 mm，在范围内扫描累加3次。扫描速度50 nm/min，猪肉12-LOX酶液浓度0.1 mg/mL。用平均椭圆率[θ]表示CD数据，单位為deg·cm2/dmol（Parker and Rees，1960）。

1. 2. 7 EDTA对猪肉12-LOX荧光光谱的影响 蛋白质分子中的芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸基团具有内源荧光性，在一定波长照射下会产生荧光，且荧光的产生会随着外界条件的改变而变化，因此蛋白质三级结构的变化可通过荧光光谱分析（Zhong et al.，2009）。具体方法：在1 mL EP管中加入不同浓度EDTA ，然后加入50 μL猪肉12-LOX酶液（稀释至0.1 mg/mL），混匀后测定其在290～450 nm的荧光光谱，所有试验重复3次，以50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.6）为空白对照。激发波长280 nm，激发及发射光栅狭缝宽5 nm，激发狭缝宽度设为3 nm，速率240 nm/min。

2 结果与分析

2. 1 EDTA对猪肉12-LOX活力的影响

由图1可知，随着EDTA的加入，猪肉12-LOX活力逐渐降低。EDTA浓度较低时，对猪肉12-LOX活力影响不明显，其酶活力基本没有变化，随着EDTA浓度的增加，猪肉12-LOX活力快速下降。当EDTA浓度为5.0 mmol/L时，猪肉12-LOX活力降至原来的80%;当EDTA浓度为10.0 mmol/L时，猪肉12-LOX活力已下降至40%左右;而EDTA浓度为20.0 mmol/L时，LOX完全失去活性。LOX是一种含非血红素铁的蛋白质，EDTA作为一种金属离子螯合剂能与铁离子结合，从而使猪肉12-LOX活力降低甚至消失。

2. 2 EDTA对猪肉12-LOX储藏稳定性的影响

液态酶在常温条件下容易失活，即使在4 ℃下，酶活也不易保持。如图2所示，猪肉12-LOX在4 ℃下酶活力不稳定，储藏5 d后酶活力丧失30%左右，7 d后酶活力丧失55%左右。在加入EDTA后，猪肉12-LOX活力较稳定，储藏5 d后酶活力丧失20%左右，7 d后酶活力丧失40%左右。可见，EDTA对猪肉12-LOX的稳定性有一定促进作用。

2. 3 EDTA对猪肉12-LOX热稳定性的影响

LOX是一种热不稳定性酶，在受热条件下易失活。由图3可知，在50 ℃受热条件下，猪肉12-LOX的酶活力一直下降，水浴8 min时酶活力已降至原来的20%左右;在加入EDTA后，水浴8 min时酶活力下降至原来的30%左右，猪肉12-LOX对热变性的抵抗能力有所提高，失活率有所下降，酶活残余量略有增加。

2. 4 EDTA对猪肉12-LOX催化亚油酸反应的影响

如图4所示，在0～15 min内，两种反应体系中猪肉12-LOX活力均呈逐渐升高趋势，其中加入EDTA的反应体系中酶活力有所降低。在随后的反应中，加入EDTA的反应体系中猪肉12-LOX活力不再升高，达到反应平衡，而未加EDTA的反应体系中其酶活力略有升高后达反应平衡，进一步证实EDTA能抑制LOX活力。

2. 5 EDTA对猪肉12-LOX CD光谱的影响

蛋白质二级结构中主要的光活性基团是肽键，其吸收峰分布在蛋白质CD的远紫外区段（190～240 nm），一般α-螺旋特征吸收峰在208和222 nm左右，β-折叠在215 nm左右有一特征吸收负峰（Greenfield，1996，2006;Li et al.，2013）。如图5所示，天然状态的LOX远紫外CD在208和222 nm处显示负双峰曲线，在215 nm处显示1个负肩峰。加入EDTA后，猪肉12-LOX在208、222和215 nm处的特征吸收峰强度下降，表明猪肉12-LOX的ɑ-螺旋和β-折叠含量降低，EDTA的加入使其二级结构发生变化，且随EDTA浓度的增加，二级结构的变化越明显。

2. 6 EDTA对猪肉12-LOX荧光光谱的影响

EDTA的加入会影响蛋白质所处的微环境，改变氨基酸中内源性荧光生色基团的位置和微环境，从而使其荧光光谱发生变化，因此可通过内源性荧光光谱来检测EDTA对蛋白质构象的影响。通过研究EDTA处理对猪肉12-LOX蛋白荧光性质的影响，可得出其构象变化信息。EDTA与猪肉12-LOX相互作用后其荧光发射光谱的变化如图6所示，随着EDTA浓度的增加，猪肉12-LOX的荧光强度逐渐降低，在EDTA浓度为20 mmol/L时，酶的内源荧光发射峰强度下降了13%，但最大发射峰（λmax）的位置未发生变化。有研究表明，λmax与色氨酸（Trp）残基所处微环境紧密相关，Trp残基位于蛋白质分子内部的非极性环境或外部的极性环境时，对应λmax小于330 nm或大于330 nm（Lefevre et al.，2007）。本研究中λmax在340 nm附近，说明其Trp残基主要分布在蛋白质分子外部的极性环境中。EDTA的加入使猪肉12-LOX在340 nm处的荧光强度降低，说明二者发生相互作用，导致猪肉12-LOX的内源荧光淬灭，但Trp残基仍处在极性环境中。

3 讨论

EDTA是一种金属离子螯合物，蔡燕（2011）研究了外源铜离子与铁离子加入对LOX酶活体系的影响，沈洁等（2017）研究了EDTA对大豆LOX活性和催化体系的影响，而本研究探讨EDTA加入对猪肉12-LOX酶活体系的影响。结果显示，在猪肉12-LOX酶活体系中加入EDTA后，其酶活力逐渐下降，当EDTA浓度为10.0 mmol/L时，猪肉12-LOX活力约下降60%，是因为EDTA与酶活性中心的铁离子结合，使酶变为非活性态，从而酶活力下降。EDTA对猪肉12-LOX的稳定性有一定促进作用，加入EDTA 5 d后酶活力丧失约20%，7 d后酶活力丧失40%左右，均比未加EDTA组的酶活性提高10%左右;EDTA也能提高猪肉12-LOX的热稳定性，在50 ℃受热条件下，水浴8 min时其活力已下降至原来的20%左右，在加入EDTA后，水浴8 min时酶活力下降至原来的30%左右，酶活力提高10%，与沈洁等（2017）的研究结果一致。这可能是因为EDTA作为一种金属离子螯合剂，能够与LOX活性中心的铁离子结合，从而使酶活降低，使其储藏稳定性和热稳定性有所提高。CD光谱结果表明，EDTA的加入能降低猪肉12-LOX内部的α-螺旋和β-折叠含量，引起其二级结构发生变化。荧光强度随着EDTA的加入逐渐降低，在EDTA浓度为20.0 mmol/L时，酶的内源荧光发射峰强度下降13%，说明EDTA与猪肉12-LOX相互作用引起LOX的内源荧光淬灭。这与沈洁等（2017）的研究结果存在差异，可能是由于酶源及实验条件的不同所致。

本研究仅添加单一的EDTA，分析其对猪肉12-LOX活性的影响，下一步将研究其他外源物质的加入及EDTA组合对猪肉12-LOX活性的影响，从而更好地控制肉品加工过程中的LOX活性。

4 结论

EDTA能抑制猪肉12-LOX活性，降低LOX荧光强度及内部α-螺旋和β-折叠含量，引起其二级结构发生变化。此研究可为肉制品贮藏和加工过程中LOX的调控提供参考。

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（責任编辑 罗 丽）