基于AFLP标记的贵州及其邻省薏苡种质资源遗传多样性分析

李秀诗 周祥 李志芳 黎青 杨成龙 周明强 付瑜华

摘要：【目的】分析貴州及其邻省薏苡种质的遗传多样性，为薏苡种质资源的保护、遗传改良及创新利用提供理论依据。【方法】利用AFLP标记对来源于贵州及其邻省的141份薏苡种质进行遗传多样性分析及聚类分析。【结果】6对AFLP引物组合从141份薏苡种质中共扩增出830条清晰的条带，其中多态性条带为742条，多态性比例为89.40%，平均每对引物组合扩增多态性条带123.67条，有效等位基因数（Ne）为1.35～1.50，平均1.44;Nei’s遗传多样性指数（H）为0.21～0.30，平均为0.26;Shannon’s信息指数（I）为0.33～0.45，平均为0.40。来自贵州及其邻省的141份薏苡种质分为两大类群，第Ⅰ大类群包含63份薏苡种质，其中来源于贵州27份、广西6份、湖南15份、云南7份、重庆5份和四川3份，该类群可细分为Ⅰ-A和Ⅰ-B 2个亚群;第Ⅱ大类群包含78份薏苡种质，其中来源于贵州44份、广西3份、湖南5份、云南18份和四川8份，该类群可细分为Ⅱ-A、Ⅱ-B、Ⅱ-C和Ⅱ-D 4个亚群。在每个亚群中，同一地区或毗邻地区的薏苡种质亲缘关系较近，跨区跨省的薏苡种质资源亲缘关系远，仅有少量不同地区的薏苡种质被聚为一个类群。【结论】贵州及其邻省的薏苡种质交流相对较频繁，遗传基础较狭窄，遗传多样性较低。

关键词： 薏苡;种质资源;遗传多样性;AFLP;贵州省

中图分类号： S519.024                             ;文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）09-1931-06

Abstract：【Objective】The genetic diversity of Coix lacryma-jobi L. germplasm from Guizhou and its adjacent pro-vinces was analyzed to provide important theoretical basis for the protection， genetic improvement and innovative utilization of C. lacryma-jobi germplasm resources in Guizhou. 【Method】AFLP molecular markers were used to analyze genetic diversity and cluster analysis of 141 C. lacryma-jobi germplasm resources from Guizhou and its adjacent provinces. 【Result】Six pairs of AFLP primer combinations amplified a total of 830 clear bands from 141 C. lacryma-jobi germplasm resources，among which 742 were polymorphic bands and the proportion of polymorphic loci was 89.40% with the average number of 123.67 polymorphic bands per pair of primer. The number of effective alleles（Ne） was 1.35 to 1.50 with an ave-rage of 1.44，the variation of Nei’s genetic diversity index（H） was 0.21 to 0.30 with an average of 0.26， and Shannon’s information index（I） was 0.33 to 0.45 with an average of 0.40. The neighbor-joining method grouped 141 Coixlacryma-jobi germplasm resources into two major clusters. Cluster I consisted of 63 germplasms including 27 from Guizhou， 6 from Guangxi， 15 from Hunan， 7 from Yunnan， 5 from Chongqing and 3 from Sichuan， this cluster could be further divided into sub-cluster Ⅰ-A and sub-clusterⅠ-B. Cluster II had 78 germplasms including 44 from Guizhou， 3 from Guangxi， 5 from Hunan， 18 from Yunnan and 8 from Sichuan， which could be further grouped into four sub-clusters（Ⅱ-A，Ⅱ-B， Ⅱ-C and Ⅱ-D）. In each sub-cluster，the genetic relationship of C. lacryma-jobi germplasm resources from the same region or adjacent areas was relatively close while those across regions and provinces were far. Only a small number of C. lacryma-jobi germplasm resources across regions and provinces were clustered into one group. 【Conclusion】The exchange of C. lacryma-jobi germplasm between Guizhou and its adjacent provinces is relatively frequent resulting in germplasm resour-ces from these region had narrow genetic basis and low genetic diversity.

Key words： Coix lacryma-jobi L.; germplasm resources; genetic diversity; AFLP; Guizhou Province

0 引言

【研究意义】薏苡（Coix lacryma-jobi L.）是禾本科薏苡属重要的药食同源作物，俗称药玉米、水玉米（东北）、晚念珠（福建）和六谷米（广西）等，具有较高的营养、保健及药用价值，其果实薏苡仁具有促进新陈代谢、抗肿瘤、镇痛、利尿、降血糖等功效（赵婕等，2016;张旭娜等，2018），被广泛应用于医疗、美容和食品等领域（张小永等，2014;党娟，2015）。薏苡产业是贵州传统产业之一，随着全省产业结构调整，薏苡种植面积逐年增加，约占全国种植面积的50%（Diao，2017），薏苡仁副产品也逐渐走向成熟（党娟，2015;邓素芳等，2016）。但目前生产上栽培的薏苡品种单一，缺乏优质薏苡新品种（张国兵等，2016;夏法刚等，2017），对薏苡种质资源的改良和创新利用不够，野生薏苡种质资源也锐减（李碧娟，2017）。因此，研究薏苡种质资源的遗传多样性对发掘和筛选薏苡优异种质资源具有重要意义。【前人研究进展】分子标记技术已广泛应用于农作物种质资源的鉴定评价及其遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位等（吕杰，2012;苗晗等，2014;唐浩等，2015），但在薏苡种质资源的相关研究中，多采用SRAP和SSR标记。如梁云涛等（2008）利用SSR标记分析来源于日本、韩国及我国广西的77份薏苡种质的亲缘关系及遗传基础;Ma等（2010）利用SSR标记对来源于我国和韩国的79份薏苡种质进行遗传多样性和亲缘关系分析;郭银萍等（2012）利用SSR标记初步分析22份贵州薏苡种质的遗传多样性;王硕等（2015）利用SRAP标记分析来源于越南、老挝及我国云南、山西、山东、陕西等地区的25份薏苡种质的遗传多样性;Xi等（2016）利用ISSR标记、形态特征和化学组分对我国四川、辽宁、山东、安徽、福建、贵州等9个省（区）的11份薏苡种质进行遗传多样性分析及亲缘关系鉴定;夏法刚等（2017）利用SRAP标记分析我国台湾、浙江、河南、湖南、云南、广东等10个省（区）90份薏苡种质的遗传多样性并构建其DNA指纹图谱。【本研究切入点】AFLP标记具有多态性强、重复性好等优点，是一种理想、有效的遗传标记，但目前鲜见利用该标记进行薏苡种质遗传多样性分析的研究报道。【拟解决的关键问题】利用AFLP标记对贵州及其邻省的141份薏苡种质进行遗传多样性分析，以了解贵州及其邻省薏苡种质的亲缘关系，为贵州薏苡种质资源的保护、遗传改良及创新利用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的141份薏苡种质是贵州省农业科学院贵州省亚热带作物研究所从贵州5个行政区（黔西南、黔南和黔东南、铜仁市和遵义市）及其4个邻省即湖南（张家界市）、四川（重庆市、成都市、简阳市、自贡市和内江市）、云南（曲靖市和文山市）和广西（百色市）等地区收集获得，详见表1。主要试剂：Taq酶（2 U/μL）和dNTP（10 mmol/L）购自北京博友顺生物技术有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，内切酶EcoR I（10 U/μL）、Mse I（10 U/μL）和T4连接酶（5 U/μL）购自NEB（北京）公司。主要仪器设备：DYY-6B电泳仪（北京六一仪器厂）、GELl-DOC2000凝胶成像分析仪、PCR扩增仪（美国Bio-Rad 公司）和A3730XL测序仪（美国Applied Biosystems公司）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取 将141份薏苡种质种植在贵州省农业科学院贵州省亚热带作物研究所种质资源圃中，于苗期采集各材料叶片，用CTAB法提取DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，并将DNA稀释至50 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱备用。

1. 2. 2 AFLP分析 参照孙凤梅等（2014）的方法进行AFLP分析，适当优化调整。用于AFLP分析的接头和引物序列见表2。取DNA样品约250 ng，用EcoR I和Mse I 37 ℃酶切3 h，再65 ℃酶切3 h。用T4连接酶将酶切产物与50 μmol/L EcoR I接头和Mse I接头在16 ℃水浴中连接12 h，连接产物用ddH2O稀释5倍后用作预扩增模板。预扩增反应体系： 2×PCR Mix 10.0 μL，预扩增模板4.0 μL，20 μmol/L E00和M00各1.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL。预扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，进行26个循环;72 ℃延伸10 min。将预扩增产物稀释20倍后用作选择性扩增模板，以6对AFLP引物组合（含3个选择性核苷酸的FAM标记的EcoR I引物和未标记Mse I引物的引物組合）进行选择性扩增，扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 35 s，65 ℃（每循环降低0.7 ℃）35 s，72 ℃ 60 s，进行12个循环;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行23个循环;72 ℃延伸10 min。将扩增产物稀释10倍后，取1.0 μL与15.0 μL Hi-Di甲酰胺和LIZ-500溶液（100∶1）混合后进行ABI3730XL毛细管电泳，并利用Genemar-ker对6对引物组合扩增产物原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置进行比较，得出片段大小。

1. 3 统计分析

观察统计电泳图谱中35～500 bp的条带，同一位置上，有条带记为“1”，无条带记为“0”，建立（0，1）数据矩阵。利用Popgene 1.32计算遗传多样性参数，包括各引物的扩增总条带数、多态性条带数、多态性条带百分比、等位基因数（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因数（Effective number of alleles，Ne）、Shannon’s信息指数（Shannon’s information index，I）和Nei’s遗传多样性指数（Nei’s gene diversity，H）等。采用Mega 5.0和iTOL进行聚类分析。

2 结果与分析

2. 1 AFLP标记的多态性分析结果

6对AFLP引物组合从141份薏苡种质中共扩增获得830条清晰条带，其中多态性条带为742条，多态性比例为89.40%，平均每对引物组合扩增多态性条带123.67条（表3）。部分材料电泳结果见图1。E47/M58扩增获得的多态性条带最少，为84条，E48/M85扩增获得的多态性条带最多，为161条;6对引物的Ne为1.35～1.50，平均为1.44;H为0.21～0.30，平均为0.26;I为0.33～0.45，平均为0.40（表3），说明贵州及其邻省的薏苡种质资源遗传基础较狭窄，遗传多样性较低。整体来看，在6对AFLP引物组合中，E38/M51和E48/M85扩增条带稳定、多态性高，能较好地反映贵州及其邻省薏苡种质资源的遗传多样性信息。

2. 2 聚类分析结果

由图2可知，141份薏苡种质分为两大类群，其中，第Ⅰ大类群包含63份薏苡种质，其中，来源于贵州27份（黔西南8份、黔东南2份、铜仁10份和遵义7份）、广西6份、湖南15份、云南7份、重庆5份和四川3份，该类群可细分为Ⅰ-A和Ⅰ-B 2个亚群;第Ⅱ大类群包含78份薏苡种质，其中，来源于贵州44份（黔西南28份、黔东南1份、黔南5份、铜仁2份和遵义8份）、广西3份、湖南5份、云南18份和四川8份，该类群可细分为Ⅱ-A、Ⅱ-B、Ⅱ-C和Ⅱ-D 4个亚群。综合分析发现，141份薏苡种质并未完全按照地理来源聚类，但在每个亚群中，同一地区或毗邻地区的薏苡种质资源亲缘关系较近，跨区跨省的薏苡种质资源亲缘关系较远，仅有少量不同地区薏苡种质被聚为一个类群，如贵州铜仁、遵义和黔东南与湖南、重庆和广西的大部分薏苡种质亲缘关系较近，归为一个类群;黔西南与云南和四川的薏苡种质亲缘关系较近，归为一个类群，说明贵州省的薏苡种质与毗邻地区的薏苡种质资源交流相对较频繁。

3 讨论

本研究利用AFLP标记对贵州及其邻省的141份薏苡种质资源进行遗传多样性分析，共获得830条清晰条带，其中多态性条带为742条，多态性比例达89.40%，比夏法刚等（2017）利用88对SRAP引物从90份薏苡种质中扩增获得的多态性条带比例（84.86%）高，比王硕等（2015）利用6对SRAP引物从25份薏苡种质中扩增获得的多态性条带比例（93.00%）低，但明显高于AFLP标记在玉米（72.00%）（杜金友等，2003）、黄瓜（66.00%）（李锡香等，2004）和高粱（43.10%）（Shegro et al.，2013）等作物的多态性比例。可见，AFLP标记能较好地反映141份薏苡种质的遗传多样性信息，尤其是E38/M51和E48/M85扩增条带稳定、多态性高，可应用于其他薏苡种质资源的遗传多样性分析及亲缘关系鉴定评价。

本研究发现，141份薏苡种质的H为0.21～0.30，I为0.33～0.45，Ne为1.35～1.50，说明贵州及其邻省的薏苡种质资源遗传基础较狭窄，遗传多样性较低，与马建霞等（1999）、Ma等（2010）、Xi等（2016）的研究结果基本一致，但与夏法刚等（2017）的研究结果相反，其原因是不同研究的薏苡种质来源地存在差异，本研究仅以贵州及其邻省的薏苡种质为研究对象，地域性相对较窄。此外，本研究聚类分析结果显示，贵州及其邻省的141份薏苡种质分为两大类群，虽然所有资源并未按照地理来源完全分开，但在每个亚群中，来源于同一地区或毗邻地区的薏苡种质亲缘关系较近，跨区跨省的薏苡种质亲缘关系较远，说明薏苡种质的遗传基础较狭窄，遗传多样性较贫乏。据相关研究报道可知，薏苡种质呈现此现象可能存在以下4个主要原因：（1）同一地区或毗邻地区的人类活动和选择育种导致种质迁移（马建霞等，1999;Xi et al.，2016）;（2）薏苡是小作物，栽培面积小，地理分布零碎，跨区跨省的薏苡种质交流较少（陈成斌等，2008）;（3）薏苡属于风媒传粉的同株异序或异株授粉作物（Mello et al.，1995;李泽锋和刘昆，2012）;（4）供试样本量偏少，采集地点零碎，一定程度上影响遗传多样性。

4 结论

贵州及其邻省的薏苡种质交流相对较频繁，遗传基础较狭窄，遗传多样性较低。

参考文献：

陈成斌，梁云涛，徐志健，陆宇明，曾华忠，赖群珍，梁世春，罗毓喜. 2008. 广西薏苡种质资源考察报告[J]. 西南农业学报，21（3）：792-797. [Chen C B，Liang Y T，Xu Z J，Lu Y M，Zeng H Z，Lai Q Z，Liang S C，Luo Y X. 2008. Investigation report on job’s tears（Coix lacryma-jobi L.） germplasm resources in Guangxi[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，21（3）：792-797.]

黨娟. 2015. 萌芽薏米营养生化特性及产品延伸研究[D]. 贵阳：贵州大学. [Dang J. 2015. Research on characteristics of nutritional and biochemistry of germinated unpolished coix seed extension products[D]. Guiyang：Guizhou University.]

邓素芳，林忠宁，陆烝，应朝阳. 2016. 薏苡产品开发与利用研究进展[J]. 粮食与饲料工业，12（6）：30-34. [Deng S F，Lin Z N，Lu Z，Ying Z Y. 2016. Research progress on development and utilization of coix[J]. Cereal & Feed Industry，12（6）：30-34.]

杜金友，黎裕，王天宇，石云素，宋燕春，王海波. 2003. SSR和AFLP分析玉米遗传多样性的研究[J]. 华北农学报，18（1）：59-63. [Du J Y，Li Y，Wang T Y，Shi Y S，Song Y C，Wang H B. 2003. Studies of genetic diversity in maize inbred lines based on SSRs and AFLPs markers[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，18（1）：59-63.]

郭银萍，彭忠华，赵致，陈志兴，高翔，刘胜传，谢云. 2012. 基于SSR标记的贵州薏苡种质资源遗传多样性分析[J]. 植物遗传资源学报，13（2）：317-320. [Guo Y P，Peng Z H，Zhao Z，Chen Z X，Gao X，Liu S C，Xie Y. 2012. Genetic diversity analysis of jobs tears germplasm resources by SSR markers in Guizhou Provience[J]. Journal of Plant Genetic Resources，13（2）：317-320.]

李碧娟. 2017. 栽培薏苡农艺、品质性状评价及遗传多样性分析[D]. 重庆：西南大学. [Li B J. 2017. Evaluation of agronomic traits，quality traits，and genetic diversity analysis of Coix lacryma-jobi[D]. Chongqing：Southwest University.]

李锡香，朱德蔚，杜永臣，沈镝，孔秋生，宋江萍. 2004. 黄瓜种质资源遗传多样性及其亲缘关系的AFLP分析[J]. 园艺学报，31（3）：309-314. [Li X X，Zhu D W，Du Y C，Shen D，Kong Q S，Song J P. 2004. Studies on genetic diversity and phylogenetic relationship of cucumber（Cucumis sativus L.） germplasm by AFLP technique[J]. Acta Horticulturae Sinica，31（3）：309-314.]

李泽锋，刘昆. 2012. 辽宁薏苡的特征特性及高产栽培技术[J]. 农业科技与装备，（1）：66-67. [Li Z F，Liu K. 2012. Properties of job’s tears and high yield cultivation techniques in Liaoning Province[J]. Agricultural Science & Technology and Equipment，（1）：66-67.]

梁云涛，陈成斌，徐志健，黄娟，曾华忠，赖群珍，梁世春，罗毓喜，黄仁健. 2008. 东亚薏苡遗传资源研究[J]. 南方农业学报，39（4）：413-418. [Liang Y T，Chen C B，Xu Z J，Huang J，Zeng H Z，Lai Q Z，Liang S C，Luo Y X，Huang R J. 2008. Studies on job’s tears genetic resour-ces in East Asia[J]. Journal of Southern Agriculture，39（4）：413-418.]

吕杰. 2012. 水稻亲本资源的遗传多样性分析及指纹图谱构建[D]. 长沙：湖南师范大学. [Lü J. 2012. The genetic diversity analysis and fingerprint construction of the rice parental resources[D]. Changsha：Hunan Normal University.]

马建霞，潘泽惠，刘心恬，於虹. 1999. 薏苡属（Coix L.）2种1变种的遗传多样性及亲缘关系的初步分析[J]. 植物资源与环境学报，8（4）：11-16. [Ma J X，Pan Z H，Liu X T，Yu H. 1999. Analysis of genetic diversity and taxonomic relations among two species and one varity of Coix L.[J]. Journal of Plant Resources and Enironment，8（4）：11-16.]

苗晗，張圣平，顾兴芳，王烨，陈磊. 2014. 中国黄瓜主栽品种SSR遗传多样性分析及指纹图谱构建[J]. 植物遗传资源学报，15（2）：333-341. [Miao H，Zhang S P，Gu X F，Wang Y，Chen L. 2014. Genetic diversity aanalysis and fingerprinting construction of Chinese cucumber main cultivars by simple sequence repeat polymorphisms[J]. Journal of Plant Genetic Resources，15（2）：333-341.]

孙凤梅，沈晓霞，沈宇峰，张启坤，王志安. 2014. 薏苡AFLP体系的建立与优化[J]. 浙江农业学报，26（1）：14-19. [Sun F M，Shen X X，Shen Y F，Zhang Q K，Wang Z A. 2014. Establishment and optimization of AFLP system for coix[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis，26（1）：14-19.]

唐浩，余汉勇，张新明，魏兴华. 2015. 水稻新品种测试的标准品种DNA指纹图谱多样性分析[J]. 植物遗传资源学报，16（1）：100-106. [Tang H，Yu H Y，Zhang X M，Wei X H. 2015. Analysis on the diversity of DNA fingerprinting of the example varieties used for the test of rice new varieties[J]. Journal of Plant Genetic Resources，16（1）：100-106.]

王硕，何金宝，农民英，赵继训，杨志清. 2015. 薏苡种质资源的SRAP分子标记研究[J]. 中草药，46（1）：112-117. [Wang S，He J B，Nong M Y，Zhao J X，Yang Z Q. 2015. Research on SRAP molecular markers in germplasm resources of Coix lacryma-jobi[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs，46（1）：112-117.]

夏法剛，黄金星，季彪俊，詹福杨，谢萍萍，邓邦柱，林宏，郑金贵. 2017. 基于SRAP标记的薏苡种质资源遗传多样性及DNA指纹图谱构建[J]. 植物遗传资源学报，18（3）：413-420. [Xia F G，Huang J X，Ji B J，Zhan F Y，Xie P P，Deng B Z，Lin H，Zheng J G. 2017. Genetic diversity analysis and DNA fingerprint construction of Coix lacryma-jobi germplasm resources by SRAP marker[J]. Journal of Plant Genetic Resources，18（3）：413-420.]

张国兵，周棱波，汪灿，徐燕，白俊霞，邵明波. 2016. 薏苡新品种粱丰薏2号选育研究[J]. 农技服务，33（14）：10-11. [Zhang G B，Zhou L B，Wang C，Xu Y，Bai J X，Shao M B. 2016. Breeding of new variety Liang Fengyi 2 of Coix lacryma-jobi L.[J]. Agricultural Technology Service，33（14）：10-11.]

张小永，吴昊，郑呢喃，路遥. 2014. 薏苡营养功能以及在食品中应用的研究[J]. 粮食与食品工业，21（4）：55-57. [Zhang X Y，Wu H，Zheng N N，Lu Y. 2014. Study on nutritio-nal function of coix and its application in food[J]. Cereal & Food Industry，21（4）：55-57.]

张旭娜，么杨，任贵兴，崔波. 2018. 薏苡功能活性及应用研究进展[J]. 食品安全质量检测学报，9（7）：1579-1584. [Zhang X N，Yao Y，Ren G X，Cui B. 2018. Research advance on the biological activity and application of adlay[J]. Journal of Food Safety and Quality，9（7）：1579-1584.]

赵婕，王明力，汤翠，闫岩. 2016. 薏苡仁功能活性成分的研究进展[J]. 食品工业科技，37（18）：374-377. [Zhao J，Wang M L，Tang C，Yan Y. 2016. Research progress in the function of coix seed active ingredients[J]. Science and Technology of Food Industry，37（18）：374-377.]

Diao X. 2017. Production and genetic improvement of minor cereals in China[J]. Crop Journal，5（2）：103-114.

Ma K H，Kim K H，Dixit A，Chung I M，Gwag J G，Kim T S，Park Y J. 2010. Assessment of genetic diversity and relationships among Coix lacryma-jobi accessions using microsatellite markers[J]. Biologia Plantarum，54（2）：272-278.

Mello L V，Silva W J，Filho H P M，Balvvé R. 1995. Bree-ding systems in Coix lacryma-jobi populations[J]. Euphytica，81（2）：217-221.

Shegro A，Labuschagne M T，Biljon A V，Shargie N G. 2013. Assessment of genetic diversity in sorghum accessions using amplified fragment length polymorphism（AFLP） analysis[J]. African Journal of Biotechnology，12（11）：1178-1188.

Xi X J，Zhu Y G，Tong Y P，Yang X L，Tang N N，Ma S M，Li S，Cheng Z. 2016. Assessment of the genetic diversity of different job’s tears（Coix lacryma-jobi L.） accessions and the active composition and anticancer effect of its seed oil[J]. PloS One，11（4）：e0153269.

（责任编辑 陈 燕）