基于网络药理学探讨当归芍药散治疗慢性盆腔炎作用机制

赵志成　史佩玉　邓洁宜　邢万里　王颖

〔摘要〕 目的 基于網络药理学探讨当归芍药散治疗慢性盆腔炎的作用机制。方法 利用TCMSP数据库筛选出当归芍药散活性成分及其相关靶标基因;使用Genecards数据库筛选慢性盆腔炎靶标基因;借助STRING在线数据库获取靶标基因相互作用关系;采用David数据库进行GO生物学过程分析和KEGG通路功能富集分析;利用cytoscape软件构建当归芍药散治疗慢性盆腔炎“活性成分-作用靶标-通路”网络。结果 当归芍药散的核心活性成分有山（木示）酚、β-谷甾醇等，核心作用靶标有PTGS2、TNF、JUN等;GO生物学过程分析结果表明当归芍药散活性成分的基因功能主要表现在药物反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调节、凋亡过程的负调节、信号转导等生物学过程; KEGG结果表明当归芍药散主要作用与TNF、Toll样受体等信号通路有关。结论 当归芍药散活性成分山柰酚、β-谷甾醇等可能通过TNF、Toll样受体等信号通路作用于PTGS2、TNF-α、JUN、IL-6等关键靶标基因进而发挥其临床功效，达到治疗慢性盆腔炎等疾病的目的。

〔关键词〕 慢性盆腔炎;当归芍药散;网络药理学;通路;机制

〔中图分类号〕R285;R711       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.09.013

Exploration on Mechanism of Danggui Shaoyao Powder in Chronic Pelvic

Inflammatory Based on Network Pharmacology

ZHAO Zhicheng1， SHI Peiyu2， DENG Jieyi3， XING Wanli2， WANG Ying1*

（1. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040， China; 2. The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China; 3. The Second Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Danggui Shaoyao Powder in chronic pelvic inflammatory based on network pharmacology. Methods TCMSP database was used for screening effective components of Danggui Shaoyao Powder and related target genes; target genes for chronic pelvic inflammatory were screened by using Genecards database; interaction relationship of target genes was acquired by STRING online database; David database was used for GO biological progress analysis and pathway enrichment analysis of KEGG; active component-target-pathway network of Danggui Shaoyao Powder in chronic pelvic inflammatory was structured by Cytoscape software. Results The core active components of Danggui Shaoyao Powder were kaempferol， β-sitosterol， etc. and the core targets were PTGS2， TNF， JUN， etc. GO biological progress analysis showed that the gene functions of active components of Danggui Shaoyao Powder mainly manifested in biological progresses like drug reaction， positive regulation in transcription of RNA polymerase II promoter， negative regulation in apoptotic process， signal transduction and so on; KEGG results showed that the main function of Danggui Shaoyao Powder was related to signaling pathways like TNF signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway and so on. Conclusion Kaempferol， β-sitosterol and other active components of Danggui Shaoyao Powder may act on PTGS2， TNF-α， JUN， IL-6 and other key target genes through signaling pathways like TNF signaling pathway and Toll-like receptor signaling pathway， thus exerting its clinical efficacy， so as to achieve the goal of treating chronic pelvic inflammation and other diseases.

〔Keywords〕 chronic pelvic inflammatory; Danggui Shaoyao Powder; network pharmacology; pathway; mechanism

经方当归芍药散出自于医圣张仲景所著的《金匮要略》，由当归、茯苓、白术、白芍、泽泻和川芎等药物组成，主治“妇人怀妊，腹中疞痛”。临床上可广泛治疗多种妇科疾病，是妇科常用方之一。

慢性盆腔炎是由女性上生殖道感染而引起的一种常见妇科疾病，患者常感到明显的下腹部胀坠感、腰骶部酸胀疼痛，该疾病给患者身心健康带来较大的不良影响[1]。近年来，有较多文献证实当归芍药散对慢性盆腔炎具有确切的疗效。戴璐等[2]通过临床随机对照实验发现，当归芍药散治疗慢性盆腔炎患者的总有效率高达90%，明显优于对照组使用甲硝唑联合左氧氟沙星。同样，傅剑锋[3]把124例慢性盆腔炎患者随机分为试验组62例和参照组62例，试验组和参照组分别使用当归芍药散和妇科千金片治疗，结果显示当归芍药散治疗慢性盆腔炎的疗效明显优于妇科千金片。王志国[4]、张志鹏[5]和高升[6]等人通过大鼠动物实验推测当归芍药散治疗慢性盆腔炎的作用机制与调节机体免疫功能，降低炎症反应有关，但是研究均是通过动物实验及相关指标的测量，其具体作用机制和信号通路等尚未完全阐明。

网络药理学与传统的“一个药物，一种活性成分，一个靶标基因，一种疾病”的思维模式及框架不同[7]，其通过构建多层次的网络，从整体的角度去探究疾病与药物间的联系，具有良好的整体性，与中医药治疗疾病的整体观念与辨证论治原则相吻合[8]，已成为研究药物与疾病间关系的重要方法之一。本研究通过对现有的数据进行分析处理，运用网络药理学的方法从分子机制和信号通路层面探讨当归芍药散治疗慢性盆腔炎的具体作用机制。

1 资料和方法

1.1  当归芍药散活性成分与靶标基因的获取

本研究使用中药系统药理学分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“当归”“白芍”“茯苓”“白术”“泽泻”和“川芎”6个中药成分作为Herb name检索当归芍药散中当归、白芍、茯苓、白术、泽泻和川芎的所有活性成分，并利用口服生物利用度（OB）和类药性（DL）进行活性成分的筛选。OB是药物吸收、分布、代谢、排泄特性中最重要的药代学参数，其代表口服药物到达体循环所占口服剂量的比例，是决定活性成分DL的关键指标之一[9]。因此，本课题通过设置OB≥30%和DL≥0.18[10]来进行当归芍药散活性成分的筛选，以提高数据分析处理的价值。通过TCMSP数据库获取当归芍药散活性成分对应的靶点，并输入到STRING数据库（https：//string-db.org/），获得药物靶点的标准基因名称。

1.2  慢性盆腔炎靶标基因的筛选

以”Chronic pelvic inflammatory disease”为关键词从GeneCards： The Human Gene Databas（https：//www.genecards.org/）数据库中搜索慢性盆腔炎相关靶标基因，设置Score>10以保证数据的可处理性。

1.3  网络模型的构建和分析

将当归芍药散所有靶标基因输入到STRING数据库（https：//string-db.org/），设置物种为“Homo sapiens”，选择最高置信度”highest confidence”（0.900），并隐藏PPI网络中不相关的节点，其余参数设置保持默认，获取当归芍药散靶标基因PPI信息。同樣，获取慢性盆腔炎靶标基因PPI信息。运用Cytoscape

3.7.0软件（http：/cytoscape.org/）分别构建当归芍药散与慢性盆腔炎靶标基因PPI网络，使用软件中的Merge功能将两个PPI网络进行交集映射，得到当归芍药散治疗慢性盆腔炎作用靶标的PPI网络图。将获得的作用靶标输入到DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（GO）生物过程分析和KEGG通路分析。最后，将分析得到的KEGG通路与作用靶标、当归芍药散活性成分相对应，构建“活性成分—作用靶标—KEGG信号通路”网络图。

2 结果

2.1  当归芍药散活性成分与靶标基因的筛选

在TCMSP数据库中检索当归芍药散各药物活性成分，设置OB≥30%和DL≥0.18，同时筛去无对应靶标基因的成分，最终共获得31个活性成分（见表1）与103个靶标基因。

2.2  慢性盆腔炎靶标基因的筛选与PPI网络的构建

在GeneCards： The Human Gene Databas数据库中共筛选得到慢性盆腔炎靶标基因1014个，将当归芍药散靶标基因PPI网络与慢性盆腔炎靶标基因PPI网络进行交集映射，得到当归芍药散治疗慢性盆腔炎作用靶标PPI网络图（由于部分作用靶标未参与网络构建，故舍去），见图1。图中40个节点代表当归芍药散治疗慢性盆腔炎的作用靶标，节点颜色越深代表其在网络中度值越大，这40个作用靶标间有相互作用，表明这些作用靶标可能在某些层面上是相互关联的并通过多方面、多途径的协调起到治疗慢性盆腔炎的作用。

2.3  GO生物学过程富集分析和KEGG通路富集分析

将上述得到的当归芍药散治疗慢性盆腔炎的作用靶标导入David数据库中，选取排名前15名的GO生物学过程富集分析和KEGG通路富集分析。使用Omicshare软件（http：//www.omicshare.com）分别绘制生物学过程气泡图（见图2）和KEGG通路气泡图（见图3）。由图中可知，当归芍药散对凋亡过程的负调节、信号转导等的影响较大;当归芍药散治疗慢性盆腔炎涉及的通路主要是TNF信号通路、Toll样受体信号通路等。

2.4  当归芍药散治疗慢性盆腔炎“活性成分—作用靶标—通路”网络

将KEGG通路富集分析得到的基因富集数排名前15的通路与当归芍药散治疗慢性盆腔炎的作用靶标和活性成分相对应，得到“活性成分—作用靶标—KEGG信号通路”网络，见图4。该网络由57个节点和506条边组成，13个绿色菱形节点代表当归芍药散活性成分，29个红色圆形节点代表当归芍药散治疗慢性盆腔炎的作用靶标，15个橙色箭头节点代表KEGG信号通路，边代表三者间的相互作用。图中节点越大，说明其在网络中越重要，对慢性盆腔炎的影响也越大。网络拓扑学结果表明，山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等活性成分与PTGS2、TNF-α、JUN等靶标基因在网络中的节点度值排名靠前可能是当归芍药散治疗慢性盆腔炎的核心活性成分与核心作用靶标。网络中每种活性成分对应多个作用靶标，每个作用靶标又连接多种活性成分，且多条通路中间通过共有作用靶标相互连接，表示当归芍药散治疗慢性盆腔炎具备多成分、多靶点、多通路的特点，与中医学整体观念不谋而合。

3 讨论

本研究基于网络药理学的方法探讨当归芍药散治疗慢性盆腔炎的作用机制，结果显示山柰酚、β-谷甾醇等可能是核心活性成分。山柰酚是一种黄酮类化合物，相关研究表明其具有抗氧化反应、抗炎、保护神经等诸多作用[11]。山柰酚可以抑制PTGS2（COX-2）、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症介质的释放，减少炎症反应的发生与减轻炎症反应过程中出现的黏膜充血、水肿、局部红肿热痛等症状[12-13]。β-谷甾醇能够增强机体氧自由基清除能力，提升血清NO含量，抑制TNF-α等炎性因子的聚集与释放，下调NF-κB信号转导通路的活化[14-15]，具有广泛的抗炎活性。因此，笔者推测当归芍药散的关键活性成分与抗炎机制有一定的关联，其通过抗炎机制作用于慢性盆腔炎，与近年来研究当归芍药散治疗慢性盆腔炎的机制基本一致。

本研究预测出PTGS2、TNF-α、IL-6、JUN等為当归芍药散治疗慢性盆腔炎的核心作用靶标。PTGS2又称环氧酶-2（COX-2），在细胞受到促炎细胞因子等刺激时，COX-2 表达上调，并参与炎症的形成和发展[16]。许多实验研究表明，通过下调COX-2可以减轻炎症反应[17-18]。TNF-α、IL-6为重要的炎性因子，其大量分泌能够导致细胞因子水平的失衡与紊乱，最终引起盆腔周围结缔组织发生充血、水肿，逐渐演变成慢性盆腔炎[19-20]。c-jun在整个月经周期中对子宫内膜的细胞增殖和凋亡起作用，c-jun蛋白水平的循环变化可以防止基质细胞在晚期分泌期进入细胞凋亡[21]。因此，这些靶标基因都在炎症反应、细胞增殖与凋亡、免疫反应中起到重要作用，是当归芍药散治疗慢性盆腔炎的关键作用靶标。

KEGG富集结果显示，作用靶标显著富集在TNF信号通路、Toll样受体信号通路等信号通路上。TNF信号通路是由于TNF与TNFR1相互结合而激活，激活的TNF信号通路可以加强促炎性细胞因子、生长因子和TNF-α本身等基因的表达[22]。Toll样受体是Ⅰ型跨膜蛋白受体，属于白细胞介素-1受体超家族成员，TLRs广泛存在于免疫细胞表面，可激活先天性免疫系统产生亲炎症细胞因子，启动后天性免疫系统。TLRs介导免疫的信号转导途径中的 TLRs/NF-κB信号通路已基本阐明，此通路在免疫调节中发挥着极其重要的作用[23]。当归芍药散可能通过作用于该通路，启动如后天免疫系统，激活相关活性因子如NF-κB，调控相关炎症的基因表达，激活特异性免疫系统，抑制相关炎症因子的释放，从而起到抗炎等治疗效果，其与王志国[4]、张志鹏[5]和高升[6]等人通过大鼠动物实验推测与调节机体免疫功能有关相吻合。

综上所述，本研究通过运用网络药理学的研究方法，对当归芍药散治疗慢性盆腔炎的作用机制进行探讨，结果表明：当归芍药散活性成分山柰酚、β-谷甾醇等活性成分可能通过TNF、Toll样受体等信号通路作用于PTGS2、TNF-α、JUN、IL-6等关键靶标基因进而发挥其临床功效，达到治疗慢性盆腔炎等疾病的目的。分析结果与近年来基础研究及临床研究结果具有高度的一致性，具有一定的参考和提示价值，将为本课题组进一步深入设计实验研究当归芍药散抗炎抗菌、调控机体免疫力等复杂效用机制奠定基础，也为其它复杂成分方药的研究提供一定的方法学参考。

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