大鼠血清与心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1的相关性研究

李博维，周万兴，赵艳群，周玉良，崔晨霞

(广东药科大学附属第一医院心内科，广东 广州 510080)

MMP-2、-9作为基质金属蛋白酶(MMPs)家族的其中一员，多数分布于心肌组织中[1]，既往大量研究发现多种心血管疾病导致的心室重构过程与MMP-2、-9及其内源性抑制剂——金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的水平和比值有较密切的关系，且通过改变上述蛋白水平或比值可有效改善心室重构[2-4]。然而由于心肌组织难以获取，研究者在临床试验中多通过测定患者血清相关蛋白水平进行研究。但目前尚无研究证实血清与心肌组织MMP-2、-9、TIMP-1水平具有相关性。因此本实验就这一问题进行探讨，尝试为临床评估心室重构的新手段提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

HP5500心脏彩色多普勒超声仪(飞利浦公司)；涡旋振荡器(江苏QL-901)；-20 ℃冰箱(德国Siemens公司)；-80 ℃超低温冰箱(美国Thermo Forma公司)；低速冷冻离心机(德国Sigma公司)；台式高速冷冻离心机(德国Heracus公司)；Elx500酶标仪(美国Biotek公司)；UVS-99紫外分光光度计(ACTGENE)；Elx500酶标仪(美国Biotek公司)。

1.2 主要药品及试剂

人重组CD147蛋白(美国R&D公司)；多西环素粉剂(Sigma公司)；大鼠MMP-2ELISA试剂盒(美国Abnova公司)；大鼠TIMP-1ELISA试剂盒、大鼠CD147 ELISA试剂盒(美国R&D公司)；Anti-MMP-2 抗体(美国Abgent公司)；Anti-TIMP-1抗体(美国R&D公司)；Anti-CD147抗体(英国Abcam公司)。

1.3 实验动物

10只8周龄SPF级WKY雄性大鼠，30只8周龄SPF级原发性高血压大鼠(SHR)雄性大鼠均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：11400700025288。

1.4 实验设计及取材

实验取材来源于本研究组的前期实验[5-6]，将大鼠分组如下：20只8周龄雄SHR随机分为2组，每组10只。其中一组接受人重组CD147蛋白(MMPs诱导剂)尾静脉注射，另一组除接受CD147注射外，加用多西环素粉剂(DOX、MMPs活性抑制剂)溶于生理盐水后灌胃，本实验将上述两组归为干预组。另有10只8周龄SHR与10只8周龄WKY大鼠均接受等剂量生理盐水尾静脉注射及灌胃，本实验将这两组归为非干预组。饲养56 d后(16周龄)统一称质量，用10%(φ)水合氯醛(0.3～0.4 mL/100 g体质量)经腹腔注射进行全身麻醉，胸部备皮后取仰卧位固定并开腹解剖，钝性分离出下腔静脉后，用5 mL注射器在肾水平处穿刺血管采血3～5 mL，用于检验各蛋白水平，采血后迅速打开胸腔切除心脏，并分离左室，用生理盐水冲洗干净并用滤纸吸干组织水分，并保存在-80 ℃冰箱备用。

1.5 心肌组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白的检测

将-80 ℃保存的心肌组织用玻璃研磨器置于冰上研磨，并用全细胞裂解液(含PMSF)进行裂解30 min后，12 000 r/min，4 ℃台式高速冷冻离心机离心30 min。取上清液用Western blot方法进行测定[5]。

1.6 血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白的检测

抽取大鼠血液后自然凝固10～20 min，3 000 r/min低速冷冻离心机离心10 min，吸取上清液置于-20 ℃冰箱保存，用ELISA方法进行测定[7]。

1.7 统计学分析

使用SPSS 21.0统计软件，计量资料用均数±标准差表示。组间比较方差齐时用单因素方差分析，两两比较采用LSD法；方差不齐时用非参数检验。两变量相关性采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清与左室心肌组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值

干预组及非干预组大鼠血清、左室心肌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值见图1。两组之间心肌组织各蛋白水平及变化趋势可详见本研究组的前期实验[5-6]。两组间心肌组织中MMP-2/TIMP-1比值差异无统计学意义(P>0.05)，但与非干预组相比，干预组心肌组织中MMP-9/TIMP-1比值明显减少(P<0.05)。而在血清中，两组间MMP-2、MMP-9水平差异均无统计学意义(P>0.05)，干预组TIMP-1水平较非干预组有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05)。另外，两组间血清MMP-2/TIMP-1比值差异无统计学意义(P>0.05)，但干预组血清MMP-9/TIMP-1比值较非干预组增加(P<0.05)。

无论是在干预组还是在非干预组中，心肌组织MMP-2/TIMP-1比值均比血清中相关比值高(P<0.05)。在非干预组中心肌组织MMP-9/TIMP-1比值较血清中相关比值高，而在干预组中恰好相反，血清MMP-9/TIMP-1比值高于心肌组织中相关比值，两项结果差异均有统计学意义(P<0.05)。

血清与心肌各蛋白及相关比值水平3002001000非干预组干预组△#*△△△血清MMP-2(ng/mL)心肌组织MMP-2血清MMP-9(ng/mL)心肌组织MMP-9血清TIMP-9(ng/mL)心肌组织TIMP-1血清MMP-2/TIMP-1(%)心肌组织MMP-2/TIMP-1(%)血清MMP-9/TIMP-1(%)心肌组织MMP-9/TIMP-1(%)

与非干预组心肌组织比较：*P<0.05；与非干预组血清比较：#P<0.05；与同组血清比较：△P<0.05。

图1大鼠血清与左室心肌组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值

Figure1Levels and ratios of MMP-2,MMP-9 and TIMP-1 in serum and left ventricular myocardial tissue of rats

2.2 两组大鼠血清与左室心肌组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1水平及比值的相关性

干预组大鼠血清与左室心肌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白水平无明显相关性(P>0.05)，MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1比值也无明显相关性(P>0.05)。非干预组大鼠血清与心肌中MMP-2、MMP-9蛋白水平也无明显相关性(P>0.05)，但TIMP-1呈正相关(P<0.05，r=0.521，图2)，且MMP-2/TIMP-1呈明显正相关(P<0.001，r=0.758，图3)，但MMP-9/TIMP-1比值无明显相关性。

两组数据综合分析，血清与左室心肌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白水平均无明显相关性(P>0.05)，血清及心肌组织中的MMP-2/TIMP-1比值呈显著正相关(P<0.001，r=0.568，图4)，MMP-9/TIMP-1比值无明显相关性(P>0.05)。

10080604020血清TIMP-1P<0.05,r=0.5210.000.100.200.300.400.500.60心肌组织TIMP-1

图2非干预组大鼠血清与心肌组织TIMP-1的相关性

Figure2Correlation of TIMP-1 between serum and myocardial tissue in the non-intervention group

0.001.002.003.004.005.00心肌组织MMP-2/TIM-12.502.001.501.000.500.00血清MMP-2/TIMP-1P<0.001,r=0.758

图3非干预组大鼠血清与心肌组织MMP-2/TIMP-1的相关性

Figure3Correlation of MMP-2/TIMP-1 between serum and myocardial tissue in the non-intervention group

P<0.001,r=0.5860.01.02.03.04.05.0心肌组织MMP-2/TIMP-12.502.001.501.000.500.00血清MMP-2/TIMP-1

图4综合两组血清与心肌组织MMP-2/TIMP-1的相关性

Figure4Correlation of MMP-2/TIMP-1 between serum and myocardial tissue in both groups

3 讨论

本实验发现大鼠血清中MMP-2、MMP-9水平经CD147诱导后变化趋势并不如心肌组织中相关蛋白明显[5-6]，且与左室心肌组织MMP-2、MMP-9蛋白水平无明显相关性，可能与以下因素有关：本实验中干预组大鼠均接受CD147药物干预，部分同时接受DOX干预[5-6]。其中DOX是MMPs的广谱拮抗剂，主要抑制MMPs活性，一般不影响其蛋白水平[8]。但CD147作为MMPs的天然诱导物，对体内多种MMPs(如：MMP-2、-8、9、-14、MT1-MMP等)的蛋白水平及基因表达均有上调作用[9]。同时MMP-8、-14、MT1-MMP也会影响MMP-2、-9蛋白水平[1，9]。此外，CD147还对多种炎性因子(如：白介素18、环孢素A等)起上调作用，这些炎性因子也可以进一步影响MMP-2、-9蛋白水平[9]。上述结果提示，要想真实反映血清与左室心肌组织中MMPs的相关性，首先须排除外界干扰因素。但是，在剔除CD147的干预因素后，非干预组大鼠血清与左室心肌组织MMP-2、-9相关性仍不明显。这可能由于MMP-2、-9除分布于心肌组织外，还可见于成纤维细胞、血管内皮细胞、骨骼肌及多种肿瘤细胞中，既往研究发现这些细胞中的MMP-2、-9也有一定影响作用[10]。可见，血清中的MMP-2、-9蛋白水平是机体多部位、多因素综合反应的体现，未必能单独反映心肌组织相应蛋白的水平。

本实验还发现大鼠血清与左室心肌组织中MMP-2/TIMP-1比值有良好的相关性，且当剔除CD147以及DOX的干扰因素后，两者之间MMP-2/TIMP-1比值的相关性更为明显。TIMP-1作为MMPs的特异性抑制剂，可以在等分子量下1∶1非共价结合MMPs的催化区域，阻止MMPs与底物结合而调节MMPs活性[10]，在多种疾病状态下，不同的病变部位中，MMP-2、TIMP-1之间均可相互影响[11-12]。有研究认为心室重构的发生是由于MMPs、TIMPs失衡所致。既往也有临床研究发现血清中的MMPs/TIMPs比值与心室重构指标相关[13-15]。而MMP-2/TIMP-1比值正是其中一类重要的衡量指标，且本实验发现大鼠血清与左室心肌中两者比值具有良好相关性，这可能是由于MMP-2、TIMP-1蛋白虽然在全身多组织中分布并相互作用，但两者的变化趋势仍与心肌组织中的相似。但本实验发现无论在干预组还是非干预组中，血清与左室心肌组织的MMP-9/TIMP-1含量均无明显相关性。过去也有一些实验发现类似的结果。如Garcia等[7]发现不同血压的患者血清中，MMP-2及MMP-9水平及活性的变化趋势并不一致：随着血压增高，血清MMP-9水平的增幅更大，但心肌组织MMP-9水平是否存在同样趋势尚未可知。而血清与心肌MMP-9水平增幅不匹配，可能是本实验中血清与心肌MMP-9/TIMP-1相关性不明显的原因之一。

总之，本研究发现大鼠血清与心肌组织中MMP-2/TIMP-1比值有较好的相关性。由于心肌组织难以在临床实验中获取，本研究结果提示血清中MMP-2/TIMP-1比值可能可以代替心肌组织中的相关蛋白，成为评估患者心室重构的指标。血清蛋白与心肌组织蛋白水平的相关性还需进一步研究。